FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LAS HOJAS DE Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, «ASMACHILCA» AL 10% peso/volumen FRENTE A BACTERIAS SENSIBLES, PERIODO AGOSTO-NOVIEMBRE 2021 TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES Bach. RAMOS RIOS, CARMEN ROSA https://orcid.org/0000-0002-5490-3614 Bach. SANTISTEBAN PARRA, SOPHIE ISABEL PAMELA https://orcid.org/0000-0001-7565-7427 ASESOR DRA. MOYANO LEGUA, ROSA DANITZA https://orcid.org/0000-0002-8662-9971 LIMA – PERÚ 2022 DEDICATORIA Dedicado principalmente a mi hijo Juan David Roca Ramos porque es mi mayor motivación para seguir adelante y crecer profesionalmente, a mis padres Juan y Celia, a mis hermanas Milagros, Yohana y Ana por estar siempre a mi lado y a mi hermano de corazón Gabriel García por todo el apoyo incondicional ya que sin ellos no podría seguir logrando metas. Carmen Rosa Ramos Rios Dedicado a mis padres Oscar y Silvia, mis hermanos Adolph, Cecilia y Camila, mis tíos Pascual, Miguel, Pablo, Rubén gracias a su apoyo, consejos, compañía y confianza en todos estos años, he logrado convertirme en la persona que soy en la actualidad. A “miapa”, que desde el cielo me observa, cuida y protege. A mis mascotas que son una parte importante de mi vida pasada y presente, me enseñaron a ser responsable y llenan mis días de alegría. Sophie Isabel Pamela Santisteban Parra 2 AGRADECIMIENTO Agradecer a Dios por mantenernos con vida y con buena salud a todos nuestros seres queridos. A la Universidad María Auxiliadora al abrirnos las puertas y permitirnos realizar el taller de titulación. A la Dra. Rosa Danitza Moyano Legua por su apoyo, confianza y asesoramiento con valiosos conocimientos hicieron mejorar cada día este trabajo, le agradecemos también el habernos guiado durante su desarrollo. Nuestro profundo agradecimiento al Dr. Oscar Santisteban Rojas, principal colaborador durante todo este proceso, usted formó parte importante con sus aportes profesionales que lo caracterizan. Muchas gracias por sus múltiples palabras de aliento, paciencia y su dedicación en el presente trabajo. 3 ÍNDICE GENERAL Páginas RESUMEN 10 ABSTRACT 11 I. INTRODUCCIÓN 12 II. MATERIALES Y MÉTODOS 17 II.1 Enfoque y diseño de la investigación 17 II.2 Población, muestra y muestreo 18 II.3 Variables de la investigación 19 II.4 Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 20 II.5 Plan metodológico para la recolección de datos 20 II.6 Procesamiento del análisis estadístico 26 II.7 Aspectos éticos 26 III. RESULTADOS 27 IV. DISCUSIÓN 50 IV.1 Discusión de resultados 50 IV.2 Conclusiones 50 IV.3 Recomendaciones 51 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52 ANEXOS 54 ANEXO A: Instrumentos de recolección de datos 54 ANEXO B: Matriz de consistencia 56 ANEXO C: Operacionalización de las variables 58 ANEXO D: Evidencias fotográficas del trabajo de campo 59 ANEXO E: Documentos obtenidos para desarrollo de la 61 investigación 4 ÍNDICE DE TABLAS Páginas Tabla 1. Test de Eficacia microbiana del extracto acuoso, decocción de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a 27 microorganismos sensibles. Tabla 2. Test de Eficacia microbiana del extracto acuoso, decocción de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a 27 microorganismos sensibles. Tabla 3. Actividad antibacteriana del extracto acuoso al 10% peso/volumen de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Staphylococcus epidermidis empleándose 29 como control Ciprofloxacino 40 mg/mL. Tabla 4. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso al 10% peso/volumen de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Staphylococcus epidermidis 30 empleándose como control Ciprofloxacino 40 mg/mL utilizando el programa SPSS. Tabla 5. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% 30 peso/volumen. Tabla 6. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus 31 epidermidis empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 7. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a 32 Staphylococcus epidermidis empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 8. Actividad antibacteriana del extracto acuoso al 10% peso/volumen de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Staphylococcus aureus empleando como 34 control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 9. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus 34 empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL utilizando el programa SPSS. Tabla 10. Prueba de homogeneidad de varianzas de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. 35 King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Tabla 11. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de 36 5 Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Tabla 12. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus 36 empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 13. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a 38 Staphylococcus aureus empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 14. Actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Klebsiella pneumoniae empleando como 39 control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 15. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen de asmachilca frente a 40 Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL utilizando el programa SPSS. Tabla 16. Prueba de homogeneidad de varianzas de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. 40 King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Tabla 17. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% 41 peso/volumen. Tabla 18. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a 42Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 19. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen 43 frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 20. Actividad antibacteriana del extracto acuoso Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium empleando como control Ciprofloxacino 45 40 μg/mL. Tabla 21. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium 45 empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL utilizando el programa SPSS. Tabla 22. Prueba de homogeneidad de varianzas de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. 46 King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. 6 Tabla 23. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de 47 Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Tabla 24. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium 47 empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 25. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a 49 Salmonella typhimurium como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 26. Tabla de la Eficacia Microbiana del extracto acuoso, decocción de asmachilca de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, 54 “asmachilca” frente a microorganismos sensibles. Tabla 27. Tabla de Eficacia microbiana de los extractos acuosos, decocción de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” 54 frente a microorganismos sensibles, control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 28. Marcha de solubilidad del extracto etanólico de hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. 55 Tabla 29. Marcha fitoquímica/Screening fitoquímico de las hojas de 55 Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. 7 ÍNDICE DE FIGURAS Páginas Figura 1. Hojas secas de asmachilca, enviada para su clasificación 21 taxonómica Figura 2. Inflorescencia seca de asmachilca, para su clasificación 21 taxonómica Figura 3. Hojas secas y estabilizadas de Aristeguietia discolor R.M. 21 King & Rob, “asmachilca” previa a su molienda. Figura 4. Extracto acuoso de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, 23 “asmachilca” Figura 5. Halos de inhibición del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Klebsiella 28 pneumoniae (Izquierda) y Staphylococcus aureus(Derecha). Figura 6. Halos de inhibición del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a S. 28 epidermidis(izquierda) y Salmonella typhimurium (Derecha). Figura 7. Halos de inhibición del control Ciprofloxacino 40 µg/mL 29 (izquierda) y el blanco, agua. Figura 8. Media de los halos de inhibición extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% 33 peso/volumen frente a Staphylococcus epidermidis empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Figura 9. Media de los halos de inhibición del extracto acuoso de asmachilca al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus 39 empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Figura 10. Medias de los halos de inhibición del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% 44 peso/volumen frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Figura 11. Medias de los halos de inhibición del extracto acuoso de asmachilca al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium 49 empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. 8 Figura 12. Tesistas con el arbusto seco de Aristiguietia discolor R.M. 61 King & Rob, “asmachilca”. Figura 13. Hojas secas e inflorescencia de Aristiguietia discolor R.M. 61 King & Rob, “asmachilca”. Figura 14. Inflorescencias y hojas secas, mostrando el envés de las 61 hojas de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Figura 15. Bachilleres tesistas: Hojas secas y molidas de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” en cápsula de 62 porcelana. Figura 16. Obtención de decocción acuosa de Aristiguietia discolor 62 R.M. King & Rob, “asmachilca”, 93-95°C. Figura 17. Extractos acuosos de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” en estufa de aire circulante para su 62 concentración. Figura 18. Extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & 63 Rob, “asmachilca”. Figura 19. Bachilleres tesistas: Extracto de Aristiguietia discolor 63 R.M. King & Rob, “asmachilca”. Figura 20. Bachilleres tesistas: Realizando el screening fitoquímico 63 Figura 21. Bachilleres tesistas, Bach. Carmen Ramos y Bach. Sophie Santisteban mostrando las hojas secas de Aristiguietia 64 discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. 9 RESUMEN Objetivo: Determinar la actividad antibacteriana del extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a bacterias sensibles. Materiales y métodos: El estudio es de planteamiento cuantitativo, diseño experimental, de corte transversal, descriptivo. Se emplearon las hojas secas de asmachilca, se obtuvo la decocción acuosa al 10% peso/ volumen, durante 10 minutos a 93-95°C. Los extractos normalizados fueron enviados al Centro de Producción Farmacéutica, CENPROFARMA de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UNMSM para su evaluación microbiológica. Resultados: Los extractos acuosos al 10% peso/volumen mostraron los siguientes halos de inhibición: Staphylococcus aureus, 19 mm, Staphylococcus epidermidis, 19 mm, Klebsiella pneumoniae, 15 mm, Salmonella typhimurium, 10 mm, el blanco, 6 mm Las diluciones evaluadas mostraron actividad antibacteriana en forma decreciente dependiendo de la especie bacteriana. Conclusiones: Se concluye que la decocción de hojas de asmachilca muestra un buen potencial antibacteriano y podría ser utilizado para aliviar padecimientos bronquiales y otros causados por las bacterias evaluadas. Palabras claves: Actividad antibacteriana, Aristeguietia discolor R.M. King & Rob “asmachilca”, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium. 10 ABSTRACT Objective: To state the main objective of the aqueous extract of the leaves of Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” against sensitive bacteria. Materials and methods: The study has a quantitative approach, experimental design, cross-sectional, descriptive. The dried leaves of asmachilca were used, the aqueous decoction was obtained at 10% weight/volume, for 10 minutes at 93- 95°C. The standardized extracts were sent to the Center for Pharmaceutical Production, CENPROFARMA of the Faculty of Pharmacy and Biochemistry of the UNMSM for their microbiological evaluation. Result: The 10% weight/volume aqueous extracts showed the following inhibition halos: Staphylococcus aureus, 19 mm, Staphylococcus epidermidis, 19 mm, Klebsiella pneumoniae, 15 mm, Salmonella typhimurium, 10 mm, blank, 6 mm The dilutions evaluated showed decreasing antibacterial activity depending on the bacterial species. Conclusions: It’s concluded that the decoction of asmachilca leaves shows good antibacterial potential and could be used to alleviate bronchial and other ailments caused by the bacteria evaluated. Key words: Antibacterial activity, Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium. 11 I. INTRODUCCIÓN Una de las causas principales de defunción a nivel mundial son las enfermedades respiratorias (enfermedad pulmonar obstructiva crónica, EPOC, infecciones de las vías respiratorias inferiores (1). “EPOC se caracteriza por una reducción persistente del flujo de aire, los síntomas empeoran gradualmente y la disnea, que es persistente y al principio se asocia al esfuerzo, aumenta con el tiempo hasta aparecer inclusive en reposo. No siempre se llega a diagnosticar, y puede ser mortal”. A menudo, se les llama «bronquitis crónica» y “enfisema” (2). La bronquitis aguda, inflamación del árbol bronquial, tiene etiología vírica (95%) y bacteriana (<5%), mientras que la neumonía, infección aguda del parénquima pulmonar, tiene a S pneumoniae como la causa más frecuente e incluye a Gram negativos (3). El asma se caracteriza por una inflamación de las vías respiratorias y por cambios estructurales en los tejidos de las mismas (4), en cuya patogenia intervienen diversas células y mediadores de la inflamación, condicionada en parte por factores genéticos (5). Más de 95% de todos los episodios de neumonía clínica y más de 99% de muertes por neumonía en niños menores de 5 años, a nivel mundial, ocurren en los países de bajos y medianos ingresos. En 2015, en las Américas, se estimó la incidencia de la infección por el neumococo en 358 casos por 100.000 niños (301-441). En el 2013, en las Américas había una incidencia de 16,6 casos por 100000 niños menores de 5 años. Se estima que, a nivel mundial, más de 90% de las meningitis bacterianas son causadas por S. pneumoniae, H. influenzae y N. meningitidis. Actualmente en las Américas, el S. pneumoniae es el principal responsable de las meningitis bacterianas (6). En el Perú, el 2020, se han notificado 2352 episodios de neumonía en menores de 5 años en el país. Además, se han reportado 17 muertes por neumonía. En el 2019 en el mismo periodo, se notificaron 4824 episodios, la TIA fue de 17.21 episodios por 100 mil habitantes. Asimismo, se notificaron 44 muertes por neumonía (7). En las zonas rurales del Perú es casi nula conseguir medicinas para las afecciones bronquiales y se debe recurrir al empleo de plantas medicinales, entre ellas asmachilca, la cual efectivamente atenúa el proceso bronquial. 12 Actividad antibacteriana se define como la capacidad que tiene una sustancia de inhibir el incremento de una población bacteriana o para eliminarla; puede ser determinada cuantitativamente in vitro Se determinó la CIM, concentración inhibitoria mínima. Una baja actividad antibacteriana no significa resistencia, fracaso terapéutico, ni efecto adverso. El efecto bactericida se define como la capacidad para reducir la población bacteriana en un 99,9% al cabo de 24 horas, si mata al 90% de dicha población se considera bacteriostático (8). Asmachilca, taxonómicamente corresponden a Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, arbusto que pertenece a la familia de Asteraceae, de 0,5 a 1,2 m de altura, ramificado desde la base, con follaje abundante, distinguible por sus hojas largas, opuestas, con inervación reticulada y pubescencia densa en el envés, e inflorescencia. Flores hermafroditas, actinomorfas, de 1 a 2 cm de longitud (9). Asmachilca crece entre los 2000 a 4000 msnm y ocupa suelos algo secos en campos abiertos, pendientes rocosas y bordes de caminos, florece entre los meses de febrero a mayo (10). Contiene gran variedad de metabolitos secundarios (11) que pueden ser la fuente de su actividad medicinal, “planta medicinal” (contra el asma y procesos bronquiales (12, 13). Se ha demostrado la actividad antimicrobiana de los extractos de hojas de Eupatorium triplinerve Vahl, contra algunas bacterias patógenas humanas y hongos fitopatógenos, de su aceite esencial (14), del género Eupatorium L (Asteraceae) (15). Estudios previos han demostrado que Aristeguietia discolor contiene alcaloides de la 1,2- dehydropyrrolizidine (16), presencia de flavonoles (17, 18) Do Thi, (2020) estudiaron los compuestos antidiabéticos de las hojas de Eupatorium triplinerve Vahl. (Asteraceae), aislaron diez compuestos del extracto metanólico de hojas. Determinaron β- sitosterol, estigmasterol, β- sitosterol 3- O - β -D-glucopiranósido, ayapanina, ayapina, timoquinol 5- O - β - D-glucopiranósido, tiriflósido, (E) -4-metoximelilotosido y kaempferol 3,7-di- O- β -D-glucopiranósido mediante el uso de técnicas ESI-MS, 1D (1H-, 13C-, DEPT) y 2D NMR (HSQC, HMBC y NOESY). Algunos compuestos se aislaron por primera vez de Eupatorium triplinerve. Se utilizó RMN y el análisis de HPLC para seleccionar y establecer los fitoquímicos en muestras de plantas (19). 13 Rama V. (2018), investigó la actividad antiulcerosa del etanol y extractos acuosos de partes aéreas de la planta (familia Asteraceae) en ratas albinas Wistar Las partes aéreas de la planta se recolectaron, se secaron a la sombra, se pulverizaron y se extrajeron sucesivamente con etanol y agua (1:10 p/v en g/mL). El estudio fitoquímico ha revelado que ambos extractos contienen flavonoides, alcaloides, esteroides, saponinas y glucósidos. Concluye que los extractos etanólicos y acuosos han demostrado poseer una actividad antiulcerosa eficaz (20). Nogueira A. (2017), muestra una revisión de las especies de la familia Asteraceae y del género Eupatorium, resaltando su alto potencial biológico y su uso en la medicina popular para tratar diversas enfermedades. Los resultados muestran una actividad antimicrobiana y antifúngica prometedora. Para la revisión de la actividad antimicrobiana y fitoquímica de las especies del género Eupatorium se usó diversas bases de datos, entre ellas PubMed, ScienceDirect, Scopus, Scielo, SciFinder y Google Scholar. Las especies de Eupatorium son ricas en terpenos, fitoesteroles y lactonas sesquiterpénicas, siendo estos últimos marcadores quimiotaxonómicos del grupo, con amplia actividad anticancerosa, antiplasmodial y antimicrobiana, lo que las hace prometedoras para el desarrollo de nuevos fármacos. La confirmación científica de sus propiedades antimicrobianas haría que estas plantas sean fuentes potenciales de tratamientos más seguros y efectivos (15). Ganoza F. (2020), “Asmachilca” es el nombre común usado por varias especies empleadas para resolver problemas respiratorios como el asma. Eupatorium triplinerve/Ayapana triplinervis/Eupatorium ayapana, Aristeguietia gayana / Eupatorium gayana y Baccharis sp. Estas especies (Asteraceae) poseen similar efecto benéfico para tratar afecciones respiratorias “como el asma bronquial, debido a su efecto broncodilatador, además tratan la tos, resfríos, inclusive como antiinflamatorio.” Concluye que es necesario estandarizar el nombre “Asmachilca” para una especie específica. Todas las especies tienen el mismo beneficio, para aliviar los problemas respiratorios (asma bronquial). Se deduce que la presencia de los compuestos como flavonoides y fenoles serían los mayores responsables del efecto relajante del endotelio y generarían un efecto broncodilatador (21). 14 Solís-Quispe, L (2019), determinó la actividad antibacteriana por el método de difusión en disco y precisó la concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima bactericida frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Salmonella tiphymurium, mostrando el aceite esencial de las hojas de Ageratina pentlandiana (DC.) R.M. King & H. Rob., determinando una marcada actividad antibacteriana, especialmente contra S. aureus y B. subtilis (22). Alvarado, B (2017) realiza encuestas a pobladores sobre el conocimiento tradicional de las 35 especies de su estudio, “el tamizaje fitoquímico indica la presencia de metabolitos secundarios, se evidencia la actividad antioxidante y la actividad citotóxica en la mayoría de las 35 plantas medicinales de la Cordillera Negra” (11). El objetivo de la presente investigación fue determinar la actividad antibacteriana del extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a bacterias sensibles. La hipótesis que planteó la investigación: “El extracto acuoso de las hojas Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen, presenta actividad antibacteriana. 15 II. MATERIALES Y MÉTODOS II.1. Enfoque y diseño de la investigación Enfoque: Este estudio es de enfoque cuantitativo. Porque recopila los datos correspondientes de la medición de los halos de inhibición determinados experimentalmente para medir la actividad antibacteriana de los extractos de asmachilca y aportar información científica que sustente su uso por nuestra población. Diseño de la investigación: Experimental: Porque aplica dos variables, condiciones de extracción de componentes (metabolitos secundarios, causa) y su efecto, el halo de inhibición (efecto). Prospectivo: Se inició en los meses de enero-abril (con la recolección de la muestra de asmachilca). Transversal: La evaluación microbiológica se realizó en un único intervalo de tiempo, agosto-octubre del 2021. Aplicada: Se buscó acreditar información científica para justificar el uso del recurso vegetal y se obtuvieron resultados reproducibles. II.2. Población, muestra y muestreo El arbusto sujeto de investigación fue Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, asmachilca, planta silvestre que crece en la serranía de la región Ancash, provincia de Huaraz por encima de los 2500 msnm. Se recolectaron 10 kg de arbusto fresco, planta que crece en las chacras y acequias de Huaraz. Para obtener el extracto acuoso se emplearon 10 g de las hojas secas y estabilizadas de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” previamente molidas. 16 La concentración empleada fue 10% masa/volumen y el solvente agua destilada. Muestra de hojas de asmachilca. Criterio de inclusión ● Hojas de asmachilca sanas y de color verde. ● Plantas con flores. Criterio de exclusión ● Hojas de asmachilca deterioradas o marchitas. ● Plantas sin flores y con signos de contaminación (colores diferentes, infestadas por hongos o en aparente deterioro microbiano). Muestras de bacterias sensibles ● Staphylococcus aureus ATCC®6538. ● Staphylococcus epidermidis ATCC®12228. ● Klebsiella pneumoniae ATCC®12538. ● Salmonella typhimurium ATCC®14028. Criterios de inclusión ● Colonias con características macroscópicas similares. ● Colonias con características microscópicas similares. Criterios de exclusión ● Cepas sin identificación ATCC. ● Cepas contaminadas o con características diferentes. 17 II.3. Variables de investigación Variable independiente: Extracto acuoso de hojas de asmachilca. Definición conceptual: Dispersión obtenida de la decocción de hojas molidas a diferentes temperaturas y tiempos. Definición operacional: 10 gramos de hojas se sometieron a decocción a 93-95°C durante 10 minutos. Variable dependiente: Actividad antibacteriana. Definición conceptual: Efecto de detener la proliferación o crecimiento bacteriano, determinado mediante el halo de inhibición. Definición operacional: Medición de los diámetros de los halos de inhibición con la ayuda de un vernier. II.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos La técnica empleada fue la de observación experimental. Los instrumentos fueron: Fichas de observación de ad- doc: prueba de solubilidad (anexo A pág.56). Fichas de observación de ad- doc: marcha fitoquímica (anexo A pág.56). Fichas para los datos de medición de los halos de inhibición del control y de los extractos acuosos. Regla para la medición de halos. II.5. Plan metodológico para la recolección de datos Recolección del arbusto Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Secado y estabilizado. Separación de las hojas de los tallos e inflorescencias. Reducción del tamaño de partícula, molienda con molino de martillos, desecación y estabilizado. 18 Obtención del extracto acuoso y normalización de su concentración. Screening fitoquímico. Determinación del extracto al laboratorio especializado para la determinación de su actividad antibacteriana. Evaluación de la actividad antibacteriana, mediante la medición de los halos de inhibición, registro en formatos respectivos e ingreso a la base de datos de Microsoft Office Excel 2013. Recolección, secado y estabilizado de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, asmachilca. Se recolectaron el equivalente de “un saco” de asmachilca en las chacras y caminos de las alturas de Huaraz. El peso de la planta fresca superó los 10 kg. Se procedió al secado, inicialmente sobre superficies limpias y bajo corrientes de aire seco, entre 15 a 20°C, finalmente en una estufa de corriente de aire a una temperatura de 40°C. Una planta completa, con su inflorescencia intacta, seca fue llevada a la ciudad de Lima y fue clasificada taxonómicamente por el Magister Asunción A. Cano Echevarría, jefe del herbario de San Marcos, Museo de Historia Natural. Figura 1. Hojas secas de asmachilca, enviada para su clasificación taxonómica. 19 Figura 2. Inflorescencia seca de asmachilca, para su clasificación taxonómica. Reducción del tamaño de partícula Las hojas secas fueron separadas del tallo y sometidas a molienda empleando un molino de martillos. El material obtenido se mantuvo en un desecador para su estabilización. Figura 3. Hojas secas y estabilizadas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” previa a su molienda. Extracción mediante hervido (decocción acuosa) Dispersión resultante de la decocción de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” a temperaturas entre 93-95°C, durante 10 minutos y que contiene los metabolitos secundarios. Se empleó en la evaluación final de la actividad antibacteriana. Determinación de la sensibilidad de las bacterias al extracto Determinación de los halos de inhibición de los diversos extractos frente a bacterias para verificar su sensibilidad. Se realizó mediante el método de difusión en placa o método de Kirby Bauer. Método de difusión en placa o método de Kirby Bauer Llamado comúnmente antibiograma, cultivos con diversas especies de bacterias son observadas para verificar su sensibilidad frente al extracto de la droga a evaluar (Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”). El medio de cultivo normalmente empleado en esta prueba es el agar de 20 Mueller Hinton, por su contenido de nutrientes o sustancias que permiten su crecimiento normal. Obtención del extracto Se pesaron por separado porciones de 10 g de hojas secas o su equivalente para mantener una concentración de 10% peso/volumen. Para la infusión y decocción acuosa la temperatura varió y el tiempo de ebullición fue 10 minutos. Ante los resultados de la evaluación de la actividad antibacteriana elegimos la decocción acuosa a 93-95°C. Figura 4. Extracto acuoso de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Screening fitoquímico. La detección de los grupos químicos de metabolitos secundarios se efectuó mediante los reactivos respectivos, empleando tubos de ensayo o cápsulas de porcelana. Derivación del extracto a los laboratorios especializados. El extracto previamente fue enrasado a 250 mL (fiola) fue trasladado al laboratorio respectivo. Evaluación de la actividad antibacteriana El analista de CENPROFARMA, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UNMSM, procedió a realizar la determinación de la actividad antibacteriana 21 siguiendo los protocolos empleados estandarizados para evaluar tal actividad. Materiales Placas Petri, asa de Drigalsky, tubos de ensayo, gradilla, micropipetas, puntas para micropipetas, viales y frascos de vidrio, espátulas, sacabocado con diámetro interno de 6 mm, baguetas de vidrio, papel kraft, indicador multiparámetro de esterilización, escala de Mac Farland. Medios de cultivo Agar tripticasa soya (TSA), Caldo tripticasa soya (TSB), agar Mueller Hinton. Bacterias para evaluación (inóculos) ● Staphylococcus aureus ATCC®6538. ● Staphylococcus epidermidis ATCC®12228. ● Klebsiella pneumoniae ATCC®12538. ● Salmonella typhimurium ATCC ®14028. Equipos · Incubadora 35ºC Labor LP-11. · Autoclave Vertical Digital. RELES AL/D 50L. · Potenciómetro. INOLAB 730. · Baño María. MEMMERT WNE-10. · Balanza analítica. HR 250 AZ. · Estufa. MEMMERT UN55. · Instrumento de medición de halos vernier digital. Fase preanalítica Preparación de materiales 22 Las placas Petri limpias se esterilizan por calor seco a 180°C por dos horas. Las puntas para micropipetas, viales y tubos con tapa rosca se esterilizaron con calor húmedo a 121°C y 15 lb/in2 por 15 minutos. Preparación de los medios de cultivo Se prepararon 50 mL de caldo TSB y se esterilizó en autoclave. Se obtuvieron 250 mL de agar TSA y se esterilizó en autoclave. Se vertieron en las placas Petri cuando la temperatura alcanzó entre 45-50°C. Se preparó 2,5 L de agar Mueller Hinton, se auto clavó, se vertió en las placas Petri estériles obteniéndose una profundidad o fondo de 4 mm. El pH del agar Mueller Hinton se monitorea entre 7,0-7,6. Se obtuvieron 50 mL de suero salino fisiológico, se esterilizó en autoclave. Activación de la cepa a evaluar Se extrajo una colonia de la cepa refrigerada a 4-8°C en agar TSA, se sembró en un tubo conteniendo caldo TSB y se llevó a incubar a 37°C por 24 horas. A partir del caldo turbio se sembró en placas con agar TSA y se puso a incubar a 37° por 24 horas. Preparación de las muestras de extracto A partir de la dispersión al 10% peso/volumen se prepararon diluciones al 100%, 80%, 50% y 30% según la indicación recibida. El volumen total de dilución fue 1000 mL o 1 mL Fase analítica Preparación del inóculo Empleando colonias puras de los microorganismos se prepararon tubos con la turbidez correspondiente a 3 x 108 ufc/mL. A partir de ésta se obtuvo la concentración de 1x108 ufc/mL Inoculación de las placas Se añadió 100 ⎧L del inóculo bacteriano a 6 placas con agar Mueller Hinton para cada cepa, se esparcieron con la espátula de Drigalsky 23 Formación de los pocillos Se esterilizó el sacabocados con el alcohol y se flameó en el mechero, se hicieron los pocillos los cuales a más de 15 mm del borde de la placa. Se hicieron tres pocillos por placa. Sembrado de muestras y control Los ensayos se hicieron por triplicado. Una placa para cada concentración, cuatro placas para cada cepa. En cada pocillo se colocaron 40 mL de inóculo. Como control negativo se empleó agua destilada, 40 mL. Como control positivo se usó Ciprofloxacino, 40 mg/mL. Incubación Las placas se colocaron en la incubadora a 37°C durante 24 horas Fase pos analítica 18 a 24 horas después de iniciada la incubación se examinaron las placas. Los halos de inhibición deben ser uniformemente circulares. Se empleó un vernier digital, que mide hasta centésima de milímetro. Los valores de las mediciones por triplicado fueron promediados y redondeados para ser reportado como número natural. II.6. Procesamiento del análisis estadístico. Los datos se registraron en el formato de recolección de datos y se ingresaron a una base de datos en Excel. El análisis estadístico se realizó obteniendo tablas en Microsoft Office Excel 2013 y posteriormente empleando el programa estadístico SPSS v 26, se aplicaron métodos descriptivos, medidas de tendencia central y de dispersión, y métodos inferenciales, análisis de rangos múltiples, método de Tukey. II.7. Aspectos éticos La presente investigación no representó ningún riesgo para el ser humano o algún animal, los ensayos fueron “in vitro”. Se cumplieron los principios de 24 ética y deontología. El nivel 2 de bioseguridad (NBS-2) fue muy alto, el correspondiente a ensayos donde se manipulan microorganismos patógenos. En todo el proceso se tuvo en cuenta el respeto a los ecosistemas. Protección y seguridad del personal que realizó las pruebas. III. RESULTADOS III.1. Evaluación antibacteriana del extracto acuoso frente a bacterias sensibles. Se determinó su sensibilidad Tabla 1. Test de Eficacia microbiana del extracto acuoso, decocción de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a microorganismos sensibles. Microorganismo, 1 x 108 Extracto de asmachilca 10% peso/volumen UFC/mL (decocción sin dilución, 100%) Staphylococcus epidermidis 19 Salmonella typhimurium 10 Klebsiella pneumoniae 15 Staphylococcus aureus 19 La tabla indica los halos de inhibición de la decocción de asmachilca al 10% peso/volumen frente a bacterias patógenas al ser humano. A mayor halo la bacteria es más sensible. Tabla 2. Test de Eficacia microbiana del extracto acuoso, decocción de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a microorganismos sensibles. Diámetro de inhibición en milímetros, mm Microorganismo 1 x 108 UFC/mL Blanco Decocción de asmachilca al 10%peso/ volumen 25 Control Ciprofloxacino 100% 80% 50% 30% 40 mg/mL 29 6 25 14 11 6 Staphylococcus epidermidis 30 6 25 14 11 6 30 6 25 14 13 6 24 6 15 9 6 6 Klebsiella pneumoniae 24 6 15 9 6 6 24 6 15 9 6 6 19 6 15 12 6 6 Staphylococcus aureus 19 6 15 12 6 6 19 6 15 12 6 6 25 6 9 6 6 6 Salmonella typhimurium 25 6 9 6 6 6 25 6 9 6 6 6 La tabla indica los halos de inhibición de la decocción de asmachilca al 10% peso/volumen frente a bacterias patógenas al ser humano. Staphylococcus epidermidis muestra la mayor sensibilidad con un 83,33%, Klebsiella pneumoniae, 62,50%; Staphylococcus aureus, 78,95% y Salmonella typhimurium, 36,00% comparados a Ciprofloxacino 40 mg/mL La dilución del extracto disminuye la actividad antibacteriana. Figura 5. Halos de inhibición del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Klebsiella pneumoniae (Izquierda) y Staphylococcus aureus(Derecha). 26 Figura 6. Halos de inhibición del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a S. epidermidis(izquierda) y Salmonella typhimurium (Derecha). III.2. Análisis estadístico de la actividad antibacteriana. Tabla 3. Actividad antibacteriana del extracto acuoso al 10% peso/volumen de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Staphylococcus epidermidis empleándose como control Ciprofloxacino 40 mg/mL. Diámetro de inhibición en milímetros, mm Decocción de asmachilca al Microorganismo Control 10% peso/ volumen Ciprofloxacino Blanco 40 mg/mL 100% 80% 50% 30% 29 6 25 15 11 6 30 6 25 14 11 6 Staphylococcus epidermidis 30 6 24 12 10 4 30 5 26 13 12 5 30 6 25 14 11 6 La tabla exhibe los halos de inhibición de las diversas diluciones evaluadas. Sus actividades decrecen a medida que se diluye el extracto. El extracto inicial 27 muestra una actividad que corresponde al 83,33% de la actividad del control, Ciprofloxacino 40 mg/mL Figura 7. Halos de inhibición del control Ciprofloxacino 40 µg/mL (izquierda) y el blanco, agua. Tabla 4. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso al 10% peso/volumen de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Staphylococcus epidermidis empleándose como control Ciprofloxacino 40 mg/mL utilizando el programa SPSS Descriptivos HALOS DE INHIBICION Staphylococcus epidermidis 95% del intervalo de confianza para la N Media Desv. Desv mediaDesviación Error Mínimo Máximo Límite Límite inferior superior 30% 6 5,5000 ,83666 ,34157 4,6220 6,3780 4,00 6,00 50% 6 11,0000 ,63246 ,25820 10,3363 11,6637 10,00 12,00 80% 6 13,6667 1,03280 ,42164 12,5828 14,7505 12,00 15,00 100% 6 25,1667 ,40825 ,16667 24,7382 25,5951 25,00 26,00 Blanco 6 5,8333 ,40825 ,16667 5,4049 6,2618 5,00 6,00 Ciprofloxacino 40 g/mL 6 29,8333 ,40825 ,16667 29,4049 30,2618 29,00 30,00m Total 36 15,1667 9,41883 1,56980 11,9798 18,3535 4,00 30,00 La tabla exhibe los estadísticos descriptivos, número de muestras, media, desviación estándar, error de DS, intervalo de confianza de 95%, valores mínimos y máximos. Los resultados sugieren aplicar los estadísticos inferenciales para determinar si existen diferencias significativas de las medias de cada concentración estudiada. 28 Tabla 5. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. En la tabla se muestra el ANOVA, siendo Sig, menor a 0,05 y siendo el p valor (p < 0,05) o significancia asintótica, p < 0,05, por tanto, se rechaza la hipótesis nula, H0 y aceptamos H1, hay diferencia en las varianzas de los grupos (halos de inhibición) ANOVA HALOS DE INHIBICIÓN (Staphylococcus epidermidis) Suma de Media cuadrados gl cuadrática F Sig. Entre grupos 3091,667 5 618,333 1391,250 ,000 Dentro de grupos 13,333 30 ,444 Total 3105,000 35 Donde: H0 = hipótesis nula o hipótesis de trabajo, de igualdad, no existe diferencia significativa entre los halos de inhibición. H1 = hipótesis alterna o hipótesis del investigador, de diferencia, existe diferencia significativa en las medias de los halos de inhibición. Tabla 6. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus epidermidis empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. La tabla muestra en detalle las comparaciones entre las diversas concentraciones de los extractos, se concluye que todos los grupos son estadísticamente diferentes a excepción del blanco (Sig. > 0,05). Comparaciones múltiples Variable dependiente: HALOS DE INHIBICIÓN (Staphylococcus epidermidis) Intervalo de confianza (I) al 95% PORCENTAJE (J) PORCENTAJE Diferencia de Desv. medias (I-J) Error Sig. Límite Límite inferior superior 50% -5,50000* ,38490 ,000 -6,6707 -4,3293 80% -8,16667* ,38490 ,000 -9,3374 -6,9960 30% 100% -19,66667 * ,38490 ,000 -20,8374 -18,4960 HSD Blanco -,33333 ,38490 ,952 -1,5040 ,8374 Tukey Ciprofloxacino 40 μg /mL -24,33333 * ,38490 ,000 -25,5040 -23,1626 30% 5,50000* ,38490 ,000 4,3293 6,6707 50% 80% -2,66667* ,38490 ,000 -3,8374 -1,4960 29 100% -14,16667* ,38490 ,000 -15,3374 -12,9960 Blanco 5,16667* ,38490 ,000 3,9960 6,3374 Ciprofloxacino 40 μg/mL -18,83333 * ,38490 ,000 -20,0040 -17,6626 30% 8,16667* ,38490 ,000 6,9960 9,3374 50% 2,66667* ,38490 ,000 1,4960 3,8374 * 80% 100% -11,50000 ,38490 ,000 -12,6707 -10,3293 Blanco 7,83333* ,38490 ,000 6,6626 9,0040 Ciprofloxacino 40 μg/mL -16,16667 * ,38490 ,000 -17,3374 -14,9960 30% 19,66667* ,38490 ,000 18,4960 20,8374 50% 14,16667* ,38490 ,000 12,9960 15,3374 100% 80% 11,50000 * ,38490 ,000 10,3293 12,6707 Blanco 19,33333* ,38490 ,000 18,1626 20,5040 Ciprofloxacino 40 μg/mL -4,66667 * ,38490 ,000 -5,8374 -3,4960 30% ,33333 ,38490 ,952 -,8374 1,5040 50% -5,16667* ,38490 ,000 -6,3374 -3,9960 Blanco 80% -7,83333 * ,38490 ,000 -9,0040 -6,6626 100% -19,33333* ,38490 ,000 -20,5040 -18,1626 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -24,00000 ,38490 ,000 -25,1707 -22,8293 30% 24,33333* ,38490 ,000 23,1626 25,5040 50% 18,83333* ,38490 ,000 17,6626 20,0040 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 16,16667 * ,38490 ,000 14,9960 17,3374 100% 4,66667* ,38490 ,000 3,4960 5,8374 Blanco 24,00000* ,38490 ,000 22,8293 25,1707 50% -5,50000* ,38490 ,000 -6,2861 -4,7139 80% -8,16667* ,38490 ,000 -8,9527 -7,3806 30% 100% -19,66667 * ,38490 ,000 -20,4527 -18,8806 Blanco -,33333 ,38490 ,393 -1,1194 ,4527 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -24,33333 ,38490 ,000 -25,1194 -23,5473 30% 5,50000* ,38490 ,000 4,7139 6,2861 80% -2,66667* ,38490 ,000 -3,4527 -1,8806 50% 100% -14,16667 * ,38490 ,000 -14,9527 -13,3806 Blanco 5,16667* ,38490 ,000 4,3806 5,9527 Ciprofloxacino 40 μg/mL -18,83333 * ,38490 ,000 -19,6194 -18,0473 30% 8,16667* ,38490 ,000 7,3806 8,9527 50% 2,66667* ,38490 ,000 1,8806 3,4527 80% 100% -11,50000 * ,38490 ,000 -12,2861 -10,7139 Blanco 7,83333* ,38490 ,000 7,0473 8,6194 Ciprofloxacino 40 μg/mL -16,16667 * ,38490 ,000 -16,9527 -15,3806 DMS 30% 19,66667* ,38490 ,000 18,8806 20,4527 50% 14,16667* ,38490 ,000 13,3806 14,9527 100% 80% 11,50000 * ,38490 ,000 10,7139 12,2861 Blanco 19,33333* ,38490 ,000 18,5473 20,1194 Ciprofloxacino 40 μg/mL -4,66667 * ,38490 ,000 -5,4527 -3,8806 30% ,33333 ,38490 ,393 -,4527 1,1194 50% -5,16667* ,38490 ,000 -5,9527 -4,3806 Blanco 80% -7,83333 * ,38490 ,000 -8,6194 -7,0473 100% -19,33333* ,38490 ,000 -20,1194 -18,5473 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -24,00000 ,38490 ,000 -24,7861 -23,2139 30% 24,33333* ,38490 ,000 23,5473 25,1194 50% 18,83333* ,38490 ,000 18,0473 19,6194 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 16,16667 * ,38490 ,000 15,3806 16,9527 100% 4,66667* ,38490 ,000 3,8806 5,4527 Blanco 24,00000* ,38490 ,000 23,2139 24,7861 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 30 HDS, Diferencia Honesta Significativa DMS, Diferencia Mínima Significativa, trabaja con valor P Tabla 7. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus epidermidis empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. HALOS DE INHIBICIÓN PORCENTAJE N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 4 5 30% 6 5,5000 Blanco 6 5,8333 50% 6 11,0000 HSD Tukeya 80% 6 13,6667 100% 6 25,1667 Ciprofloxacino 40 μg/mL 6 29,8333 Sig. ,952 1,000 1,000 1,000 1,000 30% 6 5,5000 Blanco 6 5,8333 50% 6 11,0000 Tukey Ba 80% 6 13,6667 100% 6 25,1667 Ciprofloxacino 40 μg/mL 6 29,8333 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 6,000. La tabla exhibe homogeneidad de los subgrupos de extractos, con un nivel de significancia de 0.05 podemos afirmar que entre el blanco y 30% no hay diferencia significativa, son idénticos estadísticamente (se encuentran en la misma columna), mientras que los extractos 50%, 80% y 100% si tienen diferencia significativa en relación (son diferentes entre sí). Que la actividad antibacteriana se incrementa en los grupos 50%, 80% y 100% de modo correspondiente. 31 Figura 8. Media de los halos de inhibición extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus epidermidis empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Se concluye que la media de los seis grupos es diferente. Tabla 8. Actividad antibacteriana del extracto acuoso al 10% peso/volumen de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a Staphylococcus aureus empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Diámetro de inhibición en milímetros, mm Decocción de asmachilca al Microorganismo Control 10% peso/volumen Ciprofloxacino Blanco 40 μg/mL 100% 80% 50% 30% 19 6 15 12 6 6 19 6 15 12 6 6 Staphylococcus aureus 19 6 15 11 6 6 19 6 14 11 6 6 19 6 15 12 6 6 Se muestran los halos de inhibición de las diversas diluciones evaluadas. Sus actividades decrecen a medida que se diluye el extracto. El extracto inicial muestra una actividad que corresponde al 78,95% de la actividad del control, 32 Ciprofloxacino 40 μg/mL. Las concentraciones de 50% y 30% no muestran actividad antibacteriana. Tabla 9. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL utilizando el programa SPSS. Descriptivos HALOS DE INHIBICIÓN (Staphylococcus aureus ) 95% del intervalo Desv. de confianza para N Media Desviació Desv. la mediaError Mínimo Máxim n Límite Límite o inferior superior 30% 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 50% 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 80% 5 11,6000 ,54772 ,24495 10,9199 12,2801 11,00 12,00 100% 5 14,8000 ,44721 ,20000 14,2447 15,3553 14,00 15,00 Blanco 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 Ciprofloxacin o 5 19,0000 ,00000 ,00000 19,0000 19,0000 19,00 19,00 40 μg/mL Total 30 10,5667 5,13731 ,93794 8,6484 12,4850 6,00 19,00 La tabla exhibe los estadísticos descriptivos, número de muestras, media, desviación estándar, error de DS, intervalo de confianza de 95%, valores mínimos y máximos. Los resultados sugieren aplicar los estadísticos inferenciales para determinar si existen diferencias significativas de las medias de cada concentración estudiada. Tabla 10. Prueba de homogeneidad de varianzas de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico de Levene gl1 gl2 Sig. 33 Se basa en la media 16,152 5 24 ,000 HALOS DE Se basa en la 1,680 5 24 ,178 INHIBICIÓN mediana (Staphylococcus Se basa en la aureus ) mediana y con gl 1,680 5 7,692 ,248ajustado Se basa en la media recortada 12,581 5 24 ,000 Ho: las varianzas poblacionales de las pruebas son iguales (homogeneidad de varianza u homocedasticidad) H1: las varianzas poblacionales de las pruebas son diferentes En la tabla se muestra el estadístico de Levene cuyo valor es mayor de > 0.05, por tanto, las varianzas de las poblaciones son estadísticamente iguales. Las varianzas de los grupos son homogéneas. Tabla 11. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. ANOVA HALOS DE INHIBICIÓN (Staphylococcus aureus) Suma de Media cuadrados gl cuadrática F Sig. Entre grupos 763,367 5 152,673 1832,080 ,000 Dentro de grupos 2,000 24 ,083 Total 765,367 29 Donde: H0 = hipótesis nula o hipótesis de trabajo, de igualdad, no existe diferencia significativa entre los halos de inhibición. H1 = hipótesis alterna o hipótesis del investigador, de diferencia, existe diferencia significativa en las medias de los halos de inhibición. En la tabla se muestra el ANOVA, siendo Sig, menor a 0,05 y siendo el p valor (p < 0,05) o significancia asintótica, p < 0,05, por tanto, se rechaza la hipótesis 34 nula, H0 y aceptamos H1, hay diferencia en las varianzas de los grupos (halos de inhibición). Tabla 12. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Comparaciones múltiples Variable dependiente: HALOS DE INHIBICIÓN (Staphylococcus aureus) Intervalo de (I) Diferencia(J) PORCENTAJE de medias Desv. confianza al 95%PORCENTAJE (I-J) Error Sig. Límite Límite inferior superior 50% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 80% -5,60000* ,18257 ,000 -6,1645 -5,0355 30% 100% -8,80000 * ,18257 ,000 -9,3645 -8,2355 Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -13,00000 ,18257 ,000 -13,5645 -12,4355 30% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 80% -5,60000* ,18257 ,000 -6,1645 -5,0355 50% 100% -8,80000 * ,18257 ,000 -9,3645 -8,2355 Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 Ciprofloxacino 40 μg/mL -13,00000 * ,18257 ,000 -13,5645 -12,4355 30% 5,60000* ,18257 ,000 5,0355 6,1645 50% 5,60000* ,18257 ,000 5,0355 6,1645 80% 100% -3,20000 * ,18257 ,000 -3,7645 -2,6355 Blanco 5,60000* ,18257 ,000 5,0355 6,1645 Ciprofloxacino HSD 40 μg/mL -7,40000 * ,18257 ,000 -7,9645 -6,8355 Tukey 30% 8,80000* ,18257 ,000 8,2355 9,3645 50% 8,80000* ,18257 ,000 8,2355 9,3645 100% 80% 3,20000 * ,18257 ,000 2,6355 3,7645 Blanco 8,80000* ,18257 ,000 8,2355 9,3645 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -4,20000 ,18257 ,000 -4,7645 -3,6355 30% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 50% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 80% -5,60000*Blanco ,18257 ,000 -6,1645 -5,0355 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,3645 -8,2355 Ciprofloxacino 40 μg/mL -13,00000 * ,18257 ,000 -13,5645 -12,4355 30% 13,00000* ,18257 ,000 12,4355 13,5645 50% 13,00000* ,18257 ,000 12,4355 13,5645 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 7,40000 * ,18257 ,000 6,8355 7,9645 100% 4,20000* ,18257 ,000 3,6355 4,7645 Blanco 13,00000* ,18257 ,000 12,4355 13,5645 50% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 80% -5,60000* ,18257 ,000 -5,9768 -5,2232 30% 100% -8,80000 * ,18257 ,000 -9,1768 -8,4232 Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -13,00000 ,18257 ,000 -13,3768 -12,6232DMS 30% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 80% -5,60000* ,18257 ,000 -5,9768 -5,2232 50% 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,1768 -8,4232 Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 Ciprofloxacino -13,00000* ,18257 ,000 -13,3768 -12,6232 35 40 μg/mL 30% 5,60000* ,18257 ,000 5,2232 5,9768 50% 5,60000* ,18257 ,000 5,2232 5,9768 80% 100% -3,20000 * ,18257 ,000 -3,5768 -2,8232 Blanco 5,60000* ,18257 ,000 5,2232 5,9768 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -7,40000 ,18257 ,000 -7,7768 -7,0232 30% 8,80000* ,18257 ,000 8,4232 9,1768 50% 8,80000* ,18257 ,000 8,4232 9,1768 * 100% 80% 3,20000 ,18257 ,000 2,8232 3,5768 Blanco 8,80000* ,18257 ,000 8,4232 9,1768 Ciprofloxacino 40 μg/mL -4,20000 * ,18257 ,000 -4,5768 -3,8232 30% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 50% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 Blanco 80% -5,60000 * ,18257 ,000 -5,9768 -5,2232 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,1768 -8,4232 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -13,00000 ,18257 ,000 -13,3768 -12,6232 30% 13,00000* ,18257 ,000 12,6232 13,3768 50% 13,00000* ,18257 ,000 12,6232 13,3768 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 7,40000 * ,18257 ,000 7,0232 7,7768 100% 4,20000* ,18257 ,000 3,8232 4,5768 BLANCO 13,00000* ,18257 ,000 12,6232 13,3768 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. HDS, Diferencia Honesta Significativa. DMS, Diferencia Mínima Significativa, trabaja con valor P. La tabla muestra en detalle las comparaciones entre las diversas concentraciones de los extractos, se concluye que los grupos estadísticamente diferentes son 80% y 100%. Los grupos 30% y 50% no tienen actividad antibacteriana, idéntica al blanco (Sig. > 0,05). Tabla 13. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL HALOS DE INHIBICIÓN (Staphylococcus aureus) Subconjunto para alfa = 0.05 PORCENTAJE N 1 2 3 4 30% 5 6,0000 50% 5 6,0000 Blanco 5 6,0000 HSD Tukeya 80% 5 11,6000 100% 5 14,8000 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 19,0000 sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 Tukey Ba 30% 5 6,0000 36 50% 5 6,0000 Blanco 5 6,0000 80% 5 11,6000 100% 5 14,8000 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 19,0000 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5,000. La tabla exhibe la homogeneidad de los subgrupos de extractos, con un nivel de significancia de 0.05 podemos afirmar que, entre el blanco, 30% y 50% no hay diferencia significativa, son idénticos estadísticamente (se encuentran en la misma columna), mientras que los extractos 80% y 100% si tienen diferencia significativa en relación (son diferentes entre sí). Que la actividad antibacteriana se incrementa en los grupos 80% y 100% de modo correspondiente. Figura 9. Media de los halos de inhibición del extracto acuoso de asmachilca al 10% peso/volumen frente a Staphylococcus aureus empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Se observa que la media de las actividades de las concentraciones 30%, 50% y blanco son iguales, las actividades de las concentraciones 80%, 100% y control son diferentes a las anteriores. Tabla 14. Actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. 37 Diámetro de inhibición en milímetros, mm Decocción de asmachilca al Microorganismo Control 10% peso/volumen Ciprofloxacino Blanco 40 μg/mL 100% 80% 50% 30% 24 6 15 9 6 6 24 6 14 9 6 6 Klebsiella pneumoniae 24 6 16 9 6 6 24 6 15 9 6 6 24 6 15 9 6 6 La tabla exhibe los halos de inhibición de las diversas diluciones evaluadas. Sus actividades decrecen a medida que se diluye el extracto. El extracto inicial, 100%, muestra una actividad que corresponde al 62,50% de la actividad del control, Ciprofloxacino 40 μg/mL, el extracto 80%, un 37,50%. Las concentraciones del 30% y 50% no muestran actividad antibacteriana. Tabla 15. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen de asmachilca frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL utilizando el programa SPSS. Descriptivos HALOS DE INHIBICIÓN (Klebsiella pneumoniae) 95% del intervalo de Desv. confianza para la N Media Desviació Desv. media Mínim Máxim n Error o oLímite Límite inferior superior 30% 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 50% 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,000 6,00 80% 5 9,0000 ,00000 ,00000 9,0000 9,0000 9,00 9,00 100% 5 15,0000 ,70711 ,31623 14,1220 15,8780 14,00 16,00 Blanco 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 24,0000 ,00000 ,00000 24,0000 24,0000 24,00 24,00 Total 30 12,1000 6,36450 1,16199 9,7235 14,4765 6,00 24,00 38 La tabla exhibe los estadísticos descriptivos, número de muestras, media, desviación estándar, error de DS, intervalo de confianza de 95%, valores mínimos y máximos. Los resultados sugieren aplicar los estadísticos inferenciales para determinar si existen diferencias significativas de las medias de cada concentración estudiada. Tabla 16. Prueba de homogeneidad de varianzas de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico de Levene gl1 gl2 Sig. Se basa en la media 5,026 5 24 ,003 HALOS DE Se basa en la INHIBICIÓN mediana 2,133 5 24 ,096 (Klebsiella Se basa en la pneumoniae) mediana y con gl 2,133 5 8,000 ,163ajustado Se basa en la media recortada 4,953 5 24 ,003 Ho: las varianzas poblacionales de las pruebas son iguales (homogeneidad de varianza u homocedasticidad). H1: las varianzas poblacionales de las pruebas son diferentes. En la tabla se muestra el estadístico de Levene cuyo valor es mayor de > 0,05, por tanto, las varianzas de las poblaciones son estadísticamente iguales. Las varianzas de los grupos son homogéneas. Tabla 17. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. En la tabla se muestra el ANOVA, siendo Sig, menor a 0,05 y siendo el p valor (p < 0,05) o significancia asintótica, p < 0,05, por tanto, se rechaza la hipótesis nula, H0 y aceptamos H1, hay diferencia en las varianzas de los grupos (halos de inhibición) ANOVA HALOS DE INHIBICIÓN (Klebsiella pneumoniae) 39 Suma de gl Mediacuadrados cuadrática F Sig. Entre grupos 1171,500 5 234,300 1757,250 ,000 Dentro de grupos 3,200 24 ,133 Total 1174,700 29 Donde: H0 = hipótesis nula o hipótesis de trabajo, de igualdad, no existe diferencia significativa entre los halos de inhibición. H1 = hipótesis alterna o hipótesis del investigador, de diferencia, existe diferencia significativa en las medias de los halos de inhibición Tabla 18. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. La tabla muestra en detalle las comparaciones entre las diversas concentraciones de los extractos, se concluye que todos los grupos 80% y 100% son estadísticamente diferentes, las otras concentraciones son estadísticamente iguales con el blanco (Sig. > 0,05). Comparaciones múltiples Variable dependiente: HALOS DE INHIBICIÓN (Klebsiella pneumoniae ) Intervalo de confianza al 95% (I) PORCENTAJE (J) PORCENTAJE Diferencia de Desv.medias (I-J) Error Sig. Límite Límite inferior superior 50% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 80% -5,60000* ,18257 ,000 -6,1645 -5,0355 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,3645 -8,2355 30% Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -13,00000 ,18257 ,000 -13,5645 -12,4355 30% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 80% -5,60000* ,18257 ,000 -6,1645 -5,0355 HSD 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,3645 -8,2355 Tukey 50% Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 Ciprofloxacino 40 μg/mL -13,00000 * ,18257 ,000 -13,5645 -12,4355 30% 5,60000* ,18257 ,000 5,0355 6,1645 50% 5,60000* ,18257 ,000 5,0355 6,1645 100% -3,20000* ,18257 ,000 -3,7645 -2,6355 80% Blanco 5,60000* ,18257 ,000 5,0355 6,1645 Ciprofloxacino 40 μg/mL -7,40000 * ,18257 ,000 -7,9645 -6,8355 40 30% 8,80000* ,18257 ,000 8,2355 9,3645 50% 8,80000* ,18257 ,000 8,2355 9,3645 80% 3,20000* ,18257 ,000 2,6355 3,7645 100% Blanco 8,80000* ,18257 ,000 8,2355 9,3645 Ciprofloxacino 40 μg/mL -4,20000 * ,18257 ,000 -4,7645 -3,6355 30% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 50% ,00000 ,18257 1,000 -,5645 ,5645 80% -5,60000* ,18257 ,000 -6,1645 -5,0355 Blanco 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,3645 -8,2355 Ciprofloxacino 40 μg/mL -13,00000 * ,18257 ,000 -13,5645 -12,4355 30% 13,00000* ,18257 ,000 12,4355 13,5645 50% 13,00000* ,18257 ,000 12,4355 13,5645 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 7,40000 * ,18257 ,000 6,8355 7,9645 100% 4,20000* ,18257 ,000 3,6355 4,7645 Blanco 13,00000* ,18257 ,000 12,4355 13,5645 50% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 80% -5,60000* ,18257 ,000 -5,9768 -5,2232 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,1768 -8,4232 30% Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -13,00000 ,18257 ,000 -13,3768 -12,6232 30% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 80% -5,60000* ,18257 ,000 -5,9768 -5,2232 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,1768 -8,4232 50% Blanco ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -13,00000 ,18257 ,000 -13,3768 -12,6232 30% 5,60000* ,18257 ,000 5,2232 5,9768 50% 5,60000* ,18257 ,000 5,2232 5,9768 100% -3,20000* ,18257 ,000 -3,5768 -2,8232 80% Blanco 5,60000* ,18257 ,000 5,2232 5,9768 Ciprofloxacino 40 μg/mL -7,40000 * ,18257 ,000 -7,7768 -7,0232 DMS 30% 8,80000* ,18257 ,000 8,4232 9,1768 50% 8,80000* ,18257 ,000 8,4232 9,1768 80% 3,20000* ,18257 ,000 2,8232 3,5768 100% Blanco 8,80000* ,18257 ,000 8,4232 9,1768 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -4,20000 ,18257 ,000 -4,5768 -3,8232 30% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 50% ,00000 ,18257 1,000 -,3768 ,3768 80% -5,60000* ,18257 ,000 -5,9768 -5,2232 Blanco 100% -8,80000* ,18257 ,000 -9,1768 -8,4232 Ciprofloxacino 40 μg/mL -13,00000 * ,18257 ,000 -13,3768 -12,6232 30% 13,00000* ,18257 ,000 12,6232 13,3768 50% 13,00000* ,18257 ,000 12,6232 13,3768 Ciprofloxacino * 40 μg/mL 80% 7,40000 ,18257 ,000 7,0232 7,7768 100% 4,20000* ,18257 ,000 3,8232 4,5768 Blanco 13,00000* ,18257 ,000 12,6232 13,3768 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. HDS, Diferencia Honesta Significativa. DMS, Diferencia Mínima Significativa, trabaja con valor P. 41 Tabla 19. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. HALOS DE INHIBICIÓN (Klebsiella pneumoniae) Subconjunto para alfa = 0.05 PORCENTAJE N 1 2 3 4 5 30% 5 6,0000 Blanco 5 6,0000 80% 5 9,0000 HSD Tukeya 50% 5 6,0000 100% 5 15,0000 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 24,0000 Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 30% 5 6,0000 Blanco 5 6,0000 80% 5 9,0000 Tukey Ba 50% 5 6,0000 100% 5 15,0000 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 24,0000 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5,000. La tabla muestra la homogeneidad de los subgrupos de extractos, con un nivel de significancia de 0.05 podemos afirmar que, entre el blanco, 30% y 50% no hay diferencia significativa, son idénticos estadísticamente (se encuentran en la misma columna), mientras que los extractos 80% y 100% si tienen diferencia significativa en relación (son diferentes entre sí). Que la actividad antibacteriana se incrementa en los grupos 80% y 100% de modo correspondiente. 42 Figura 10. Medias de los halos de inhibición del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Klebsiella pneumoniae empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 20. Actividad antibacteriana del extracto acuoso Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Diámetro de inhibición en milímetros, mm Decocción de asmachilca al Microorganismo Control 10% peso/ volumen Ciprofloxacino Blanco 40 μg/mL 100% 80% 50% 30% 25 6 9 6 6 6 25 6 9 6 6 6 Salmonella typhimurium 25 6 8 6 5 6 25 6 7 6 4 5 25 6 9 6 6 6 La tabla exhibe los halos de inhibición de las diversas diluciones evaluadas. Sólo el extracto 100% muestra una actividad que corresponde al 36,00% de la actividad del control, Ciprofloxacino 40 μg/mL. Tabla 21. Estadísticos descriptivos de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL utilizando el programa SPSS. 43 Descriptivos HALOS DE INHIBICIÓN (Salmonella typhimurium) 95% del intervalo de confianza para la Desv. media N Media Desviaci Desv.Error Mínimo Máximoón Límite Límite inferior superior 30% 5 5,8000 ,44721 ,20000 5,2447 6,3553 5,00 6,00 50% 5 5,4000 ,89443 ,40000 4,2894 6,5106 4,00 6,00 80% 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 100% 5 8,4000 ,89443 ,40000 7,2894 9,5106 7,00 9,00 Blanco 5 6,0000 ,00000 ,00000 6,0000 6,0000 6,00 6,00 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 25,000 ,00000 ,00000 25,0000 25,0000 25,00 25,00 Total 30 9,4333 7,16641 1,30840 6,7574 12,1093 4,00 25,00 La tabla exhibe los estadísticos descriptivos, número de muestras, media, desviación estándar, error de DS, intervalo de confianza de 95%, valores mínimos y máximos. Los resultados sugieren aplicar los estadísticos inferenciales para determinar si existen diferencias significativas de las medias de cada concentración estudiada. Tabla 22. Prueba de homogeneidad de varianzas de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico de Levene gl1 gl2 Sig. HALOS DE Se basa en la INHIBICIÓN media 9,940 5 24 ,000 44 (Salmonella Se basa en la typhimurium ) mediana 1,444 5 24 ,245 Se basa en la mediana y con gl 1,444 5 9,818 ,291 ajustado Se basa en la media recortada 8,477 5 24 ,000 Ho: las varianzas poblacionales de las pruebas son iguales (homogeneidad de varianza u homocedasticidad). H1: las varianzas poblacionales de las pruebas son diferentes. En la tabla se muestra el estadístico de Levene cuyo valor es mayor de > 0.05, por tanto, las varianzas de las poblaciones son estadísticamente iguales. Las varianzas de los grupos son homogéneas. Tabla 23. Análisis de la varianza con un factor ANOVA (de una vía, one way) de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen. ANOVA HALOS DE INHIBICIÓN (Salmonella typhimurium) Suma de Media cuadrados gl cuadrática F Sig. Entre grupos 1482,167 5 296,433 988,111 ,000 Dentro de grupos 7,200 24 ,300 Total 1489,367 29 Donde: H0 = hipótesis nula o hipótesis de trabajo, de igualdad, no existe diferencia significativa entre los halos de inhibición. H1 = hipótesis alterna o hipótesis del investigador, de diferencia, existe diferencia significativa en las medias de los halos de inhibición. En la tabla se muestra el ANOVA, siendo Sig, menor a 0,05 y siendo el p valor (p < 0,05) o significancia asintótica, p < 0,05, por tanto, se rechaza la hipótesis nula, H0 y aceptamos H1, hay diferencia en las varianzas de los grupos (halos de inhibición). Tabla 24. Prueba de Tukey, Post Hoc, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 45 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Comparaciones múltiples Variable dependiente: HALOS DE INHIBICIÓN (Salmonella typhimurium ) Intervalo de confianza Diferencia al 95% (I) PORCENTAJE (J) PORCENTAJE de medias Desv. (I-J) Error Sig. Límite Límite inferior superior 50% ,40000 ,34641 ,853 -,6711 1,4711 80% -,20000 ,34641 ,992 -1,2711 ,8711 30% 100% -2,60000 * ,34641 ,000 -3,6711 -1,5289 Blanco -,20000 ,34641 ,992 -1,2711 ,8711 Ciprofloxacino 40 μg/mL -19,20000 * ,34641 ,000 -20,2711 -18,1289 30% -,40000 ,34641 ,853 -1,4711 ,6711 80% -,60000 ,34641 ,525 -1,6711 ,4711 50% 100% -3,00000 * ,34641 ,000 -4,0711 -1,9289 Blanco -,60000 ,34641 ,525 -1,6711 ,4711 Ciprofloxacino 40 μg/mL -19,60000 * ,34641 ,000 -20,6711 -18,5289 30% ,20000 ,34641 ,992 -,8711 1,2711 50% ,60000 ,34641 ,525 -,4711 1,6711 80% 100% -2,40000 * ,34641 ,000 -3,4711 -1,3289 Blanco ,00000 ,34641 1,000 -1,0711 1,0711 Ciprofloxacino HSD 40 μg/mL -19,00000 * ,34641 ,000 -20,0711 -17,9289 Tukey 30% 2,60000* ,34641 ,000 1,5289 3,6711 50% 3,00000* ,34641 ,000 1,9289 4,0711 * 100% 80% 2,40000 ,34641 ,000 1,3289 3,4711 Blanco 2,40000* ,34641 ,000 1,3289 3,4711 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -16,60000 ,34641 ,000 -17,6711 -15,5289 30% ,20000 ,34641 ,992 -,8711 1,2711 50% ,60000 ,34641 ,525 -,4711 1,6711 Blanco 80% ,00000 ,34641 1,000 -1,0711 1,0711 100% -2,40000* ,34641 ,000 -3,4711 -1,3289 Ciprofloxacino 40 μg/mL -19,00000 * ,34641 ,000 -20,0711 -17,9289 30% 19,20000* ,34641 ,000 18,1289 20,2711 50% 19,60000* ,34641 ,000 18,5289 20,6711 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 19,00000 * ,34641 ,000 17,9289 20,0711 100% 16,60000* ,34641 ,000 15,5289 17,6711 Blanco 19,00000* ,34641 ,000 17,9289 20,0711 50% ,40000 ,34641 ,260 -,3150 1,1150 80% -,20000 ,34641 ,569 -,9150 ,5150 30% 100% -2,60000 * ,34641 ,000 -3,3150 -1,8850 Blanco -,20000 ,34641 ,569 -,9150 ,5150 Ciprofloxacino 40 μg/mL -19,20000 * ,34641 ,000 -19,9150 -18,4850 30% -,40000 ,34641 ,260 -1,1150 ,3150 80% -,60000 ,34641 ,096 -1,3150 ,1150 DMS 50% 100% -3,00000 * ,34641 ,000 -3,7150 -2,2850 Blanco -,60000 ,34641 ,096 -1,3150 ,1150 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -19,60000 ,34641 ,000 -20,3150 -18,8850 30% ,20000 ,34641 ,569 -,5150 ,9150 50% ,60000 ,34641 ,096 -,1150 1,3150 80% 100% -2,40000 * ,34641 ,000 -3,1150 -1,6850 Blanco ,00000 ,34641 1,000 -,7150 ,7150 Ciprofloxacino 40 μg/mL -19,00000 * ,34641 ,000 -19,7150 -18,2850 46 30% 2,60000* ,34641 ,000 1,8850 3,3150 50% 3,00000* ,34641 ,000 2,2850 3,7150 100% 80% 2,40000 * ,34641 ,000 1,6850 3,1150 Blanco 2,40000* ,34641 ,000 1,6850 3,1150 Ciprofloxacino * 40 μg/mL -16,60000 ,34641 ,000 -17,3150 -15,8850 30% ,20000 ,34641 ,569 -,5150 ,9150 50% ,60000 ,34641 ,096 -,1150 1,3150 BLANCO 80% ,00000 ,34641 1,000 -,7150 ,7150 100% -2,40000* ,34641 ,000 -3,1150 -1,6850 Ciprofloxacino 40 μg/mL -19,00000 * ,34641 ,000 -19,7150 -18,2850 30% 19,20000* ,34641 ,000 18,4850 19,9150 50% 19,60000* ,34641 ,000 18,8850 20,3150 Ciprofloxacino 40 μg/mL 80% 19,00000 * ,34641 ,000 18,2850 19,7150 100% 16,60000* ,34641 ,000 15,8850 17,3150 Blanco 19,00000* ,34641 ,000 18,2850 19,7150 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. HDS, Diferencia Honesta Significativa. DMS, Diferencia Mínima Significativa, trabaja con valor P. La tabla muestra en detalle las comparaciones entre las diversas concentraciones de los extractos, se concluye que sólo la concentración 100% es estadísticamente diferentes a las demás concentraciones, las cuales son estadísticamente iguales (Sig. > 0,05). Tabla 25. Prueba de Tukey, subconjuntos homogéneos, de la actividad antibacteriana del extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. HALOS DE INHIBICIÓN (Salmonella typhimurium) PORCENTAJE N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 50% 5 5,4000 30% 5 5,8000 80% 5 6,0000 HSD Tukeya Blanco 5 6,0000 100% 5 8,4000 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 25,0000 sig. ,525 1,000 1,000 50% 5 5,4000 30% 5 5,8000 80% 5 6,0000 Tukey Ba Blanco 5 6,0000 100% 5 8,4000 Ciprofloxacino 40 μg/mL 5 25,0000 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5,000. La tabla exhibe homogeneidad de los subgrupos de extractos, con un nivel de significancia de 0.05 podemos afirmar que, entre el blanco, 30%, 50% y 80% no 47 hay diferencia significativa, son idénticos estadísticamente (se encuentran en la misma columna), mientras que el extracto 100% si tienen diferencia significativa. Figura 11. Medias de los halos de inhibición del extracto acuoso de asmachilca al 10% peso/volumen frente a Salmonella typhimurium empleando como control Ciprofloxacino 40 μg/mL. IV. DISCUSIÓN IV.1. Discusión de resultados Las hojas de asmachilca contiene una variedad de metabolitos secundarios que muestran actividad antimicrobiana y que sustentan su uso tradicional como medicamento contra las afecciones bronquiales y contra el asma, tal como lo concluye Rahman10, S (2008), Britt Alvarado11 (2017), Ganoza21, M (2015), Sara Terreros (2016). El extracto etanólico exhibe incipiente actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus, Gram positiva y Klebsiella pneumoniae, Gram negativa, nuestro resultado coincide con los resultados de Nogueira15, A (2017), en su investigación sobre la familia Asteraceae. La débil actividad antibacteriana mostrada puede explicarse por la poca extracción de los metabolitos secundarios por parte el etanol. Los metabolitos son más solubles en agua que en etanol. El extracto acuoso (decocto o decocción) de las hojas de asmachilca exhibe una actividad antibacteriana 83,33% frente a Staphylococcus epidermidis, 78,95% frente a Staphylococcus aureus, 62,5% frente a Klebsiella 48 pneumoniae y 36,00% frente a Salmonella typhimurium, comparados a Ciprofloxacino 40 μg/mL, 100,00% de actividad. Estos resultados coinciden con los de Sugumar14, N (2015), de Nogueira15, A (2017), quienes comprobaron la actividad de los extractos y aceites frente a microorganismos patógenos al ser humano y hongos. La ebullición y el tiempo de ebullición aumentan el poder extractante del agua y como consecuencia hay una mayor actividad antibacteriana en la decocción. IV.2. Conclusiones · Se concluye que el extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, presentó actividad antibacteriana frente a las bacterias experimentales. · El extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, presentó actividad antibacteriana frente a Staphylococcus epidermidis al 83,33% comparada con la actividad mostrada por el Ciprofloxacino 40 μg/mL (100,00%). · El extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, presentó actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus al 78,95% comparada con la actividad mostrada por el Ciprofloxacino 40 μg/mL (100,00%). · El extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, presentó actividad antibacteriana frente a Klebsiella pneumoniae al 62,5% comparada con la actividad mostrada por el Ciprofloxacino 40 μg /mL (100,00%). · El extracto acuoso de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, presentó actividad antibacteriana frente a Salmonella typhimurium al 36,00% comparada con la actividad mostrada por el Ciprofloxacino 40 μg/mL (100,00%). IV.3. Recomendaciones 49 · Se recomienda proseguir estudios para la determinación de componentes químicos presentes en el extracto acuoso de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. · Comprobar la actividad antibacteriana de las inflorescencias y de los tallos. · Normalizar la droga o recurso vegetal y sugerir como medicina alternativa. 50 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Las 10 principales causas de defunción [Internet]. Who.int. [cited 2021 . Nov 3]. Disponible en: https://www.who.int/es/news-room/fact- sheets/detail/the-top-10-causes-of-death Accesado: 12 de setiembre de 2020. Edición actualizada 2021 2 Dumitrascu GA. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). In: . Toma de Decisiones en Anestesiología. Elsevier; 2008. p. 100–1. Accesado: 12 de setiembre de 2020. Edición actualizada 2021 3 Inferior R. Infecciones del aparato [Internet]. Semfyc.es. [cited 2021 Nov . 3]. 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Tabla de la Eficacia Microbiana del extracto acuoso, decocción de asmachilca de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a microorganismos sensibles. Microorganismo, 1 x 108 Extracto de asmachilca 10% masa/volumen (decocción UFC/mL sin dilución, 100%), halos de inhibición, mm Staphylococcus epidermidis Salmonella typhimurium Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Tabla 27. Tabla de Eficacia microbiana de los extractos acuosos, decocción de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” frente a microorganismos sensibles, control Ciprofloxacino 40 μg/mL. Diámetro de inhibición en milímetros, mm Microorganismo Control Decocción de asmachilca al 10% peso/ 1 x 108 UFC/mL Ciprofloxacino Blanco volumen 40 µg/mL 100% 80% 50% 30% Staphylococcus epidermidis Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Salmonella typhimurium 53 Tabla 28. Marcha de solubilidad del extracto etanólico de hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Disolvente Solubilidad Éter de petróleo - Cloroformo - Metanol ++ Agua +++ Leyenda: (-) insoluble (++) soluble (+++) fácilmente soluble Tabla 29. Marcha fitoquímica/Screening fitoquímico de las hojas de Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Ensayo de Reacción característica Grupo de metabolitossecundarios Resultado Molish Anillo violeta en lainterfase ++ Fehling Precipitado rojo-ladrillo + FeCl3 Coloración oscura azul Compuestos fenólicos +++ NaOH 10% Coloración marrón-naranja Flavonoides + Gelatina Precipitado blanquecino Taninos ++ Shinoda Coloración rojo salmón Flavonoides ++ Dragendorff Precipitado naranja Alcaloides + Ninhidrina Coloración violeta Aminoácidos libres - Espuma Formación de espuma Saponinas + Leyenda: (-) insoluble (++) soluble (+++) fácilmente soluble 54 ANEXO B: Matriz de consistencia Formulación del problema Objetivos Hipótesis Problema General Objetivo General Hipótesis General ¿Presentará actividad antibacteriana del El objetivo de la presente investigación fue extracto acuoso de las hojas Aristeguietia El extracto acuoso de las hojas Aristeguietiadeterminar la actividad antibacteriana del discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al discolor R.M. King & Rob “asmachilca” alextracto acuoso de las hojas Aristeguietia 10% peso/volumen frente a bacterias 10% peso/volumen, presenta actividaddiscolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al sensibles? antibacteriana”.10% peso/volumen. Problemas Específicos Objetivos Específicos Hipótesis Específicas ¿El extracto acuoso de las hojas de Detectar la actividad antibacteriana del El extracto acuoso de las hojas Aristeguietia Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, extracto acuoso de las hojas Aristeguietia discolor R.M. King & Rob “asmachilca” al “asmachilca” al 10% peso/volumen, discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen, presenta actividad presentará actividad antibacteriana frente 10% peso/volumen frente a la bacteria antibacteriana in vitro frente a la bacteria Staphylococcus aureus ATCC®6538, en Staphylococcus aureus ATCC®6538 en Staphylococcus aureus ATCC®6538 en comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL? comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL ¿El extracto acuoso de las hojas de Detectar la actividad antibacteriana del El extracto acuoso de las hojas Aristeguietia Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, extracto acuoso de las hojas Aristeguietia discolor R.M. King & Rob “asmachilca” al “asmachilca” al 10% peso/volumen, discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen, presenta actividad presentará actividad antibacteriana frente 10% peso/volumen frente a la bacteria antibacteriana in vitro frente a la bacteria Staphylococcus epidermidis ATCC®12228 Staphylococcus epidermidis ATCC®12228 Staphylococcus epidermidis ATCC®12228 en comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL? en comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL en comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL ¿El extracto acuoso de las hojas de Detectar la actividad antibacteriana del El extracto acuoso de las hojas Aristeguietia Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, extracto acuoso de las hojas Aristeguietia discolor R.M. King & Rob “asmachilca” al “asmachilca” al 10% peso/volumen, discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen, presenta actividad presentará actividad antibacteriana frente 10% peso/volumen frente a la bacteria antibacteriana in vitro frente a la bacteria Klebsiella pneumoniae ATCC®12538 en Klebsiella pneumoniae ATCC®12538 en Klebsiella pneumoniae ATCC®12538 en comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL? comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL ¿El extracto acuoso de las hojas de Detectar la actividad antibacteriana del El extracto acuoso de las hojas Aristeguietia Aristeguietia discolor R.M. King & Rob, extracto acuoso de las hojas Aristeguietia discolor R.M. King & Rob “asmachilca” al “asmachilca” al 10% peso/volumen, discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” al 10% peso/volumen, presenta actividad presentará actividad antibacteriana frente 10% peso/volumen frente a la bacteria antibacteriana in vitro frente a la bacteria Salmonella typhimurium ATCC®14028 en Salmonella typhimurium ATCC®14028 en Salmonella typhimurium ATCC®14028 en comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL? comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL comparación al Ciprofloxacino 40 μg/mL 56 ANEXO C: Operacionalización de las variables VARIABLES DEFINICIÓN DEFINICIÓN ESCALA DECONCEPTUAL OPERACIONAL DIMENSIONES INDICADORES MEDICIÓN VALOR Es una dispersión -Presencia de acuosa obtenida Concentración de metabolitos EXTRACTO a partir de una extracto acuoso secundarios: Aristeguietia ACUOSO DE LAS droga vegetal de Aristeguietia Flavonoides discolor R.M. King HOJAS DE posterior a discolor R.M. Fitoquímica Alcaloides & Rob % ASMACHILCA decocción o King & Rob -Concentraciones “asmachilca” al contacto con “asmachilca” del extracto 10% peso/volumen agua hirviente acuoso. (infusión) Sensibilidad Capacidad de bacteriana frente una sustancia al extracto Medición de ACTIVIDAD para inhibir el acuoso de halos de Milímetros deMicrobiología inhibición diámetro mm deANTIBACTERIANA crecimiento de Aristiguietia cepas discolor R.M. (Diámetro de los µg/mL inhibición bacterianas King &Rob Halos) “asmachilca” 57 ANEXO D. DOCUMENTOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN CERTIFICACIÓN BOTÁNICA DE ASMACHILCA 59 ANEXO E: Evidencias fotográficas del trabajo de campo Figura 12. Tesistas con el arbusto seco de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Figura 13. Hojas secas e inflorescencia de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Figura 14. Inflorescencias y hojas secas, mostrando el envés de las hojas de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. 60 Figura 15. Bachilleres tesistas: Hojas secas y molidas de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” en cápsula de porcelana. Figura 16. Obtención de decocción acuosa de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”, 93-95°C. Figura 17. Extractos acuosos de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca” en estufa de aire circulante para su concentración. 61 Figura 18. Extracto acuoso de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Figura 19. Bachilleres tesistas: Extracto de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. Figura 20. Bachilleres tesistas: Realizando el screening fitoquímico 62 Figura 21. Bachilleres tesistas, Bach. Carmen Ramos y Bach. Sophie Santisteban mostrando las hojas secas de Aristiguietia discolor R.M. King & Rob, “asmachilca”. 63