FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA In vitro DE LA MEZCLA DE ACEITES ESENCIALES DE Cinnamomum Zeylanicum Blume (CANELA) Y Origanum vulgare L. (ORÉGANO) FRENTE A Streptococcus mutans ATCC 25175 TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES Bach. VALDERRAMA DIAZ, DIANA VERONICA https://orcid.org/0000-0003-0312-110X Bach. BUSTAMANTE GORDILLO, DOLY ADELID https://orcid.org/0000-0002-7781-2168 ASESOR Mg. PALOMINO PACHECO, MIRIAM https://orcid.org/ 0000-0002-0427-7766 LIMA – PERÚ 2022 1 DEDICATORIA A Dios, por ser mi luz en mi camino y darme las fuerzas necesarias para salir adelante a pesar de los obstáculos que se presentan, enseñándome a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento. A mis padres quienes a lo largo de mi vida han velado por mi bienestar y educación, brindándome su apoyo incondicional a cada momento para darme un futuro mejor y por ser mi principal motivación para el cumplimiento de mis metas. A mis hermanos, por confiar en mí, brindándome su apoyo y consejos para lograr mis metas. Diana Veronica Valderrama Diaz A Dios, el creador de todas las cosas, Él es quien me dio la fortaleza y el entendimiento para continuar y seguir con paso firme logrando cada uno de mis objetivos. A mis padres, por brindarme siempre su apoyo y comprensión a quienes les debo toda mi vida, han sabido formarme con buenos sentimientos, hábitos y valores, lo cual me han ayudado a salir adelante buscando siempre el mejor camino para así lograr mis metas trazadas. A mi hermana y amigos, quienes han estado conmigo brindándome sus consejos e incentivándome a seguir para adelante a pesar de muchos obstáculos en el camino. Gracias a todos. 2 Doly Adelid Bustamante Gordillo AGRADECIMIENTO A DIOS A Dios, las infinitas gracias por bendecirnos con la salud y darnos las fuerzas necesarias para no caer a pesar de las dificultades que se presentan. A NUESTROS PADRES Por ser un ejemplo, por brindarnos su apoyo incondicional y perseverancia para alcanzar nuestras metas con mucho orgullo y tener un futuro mejor. Nuestro eterno agradecimiento y retribución total por su gran amor. A LA UNIVERSIDAD MARÍA AUXILIADORA (UMA) Por acogernos y brindarnos su apoyo, a nuestra asesora Mg. Miriam Palomino Pacheco que nos ayudó a culminar nuestro proyecto. Finalmente quiero expresar mi sincero agradecimiento al Dr. Miguel Inocente y a la profesora Marleny, principales colaboradores durante todo este proceso, quienes nos brindaron sus conocimientos, enseñanzas y colaboración durante el desarrollo de nuestro proyecto. 3 ÍNDICE GENERAL Páginas RESUMEN 08 ABSTRACT 09 I. INTRODUCCIÓN 10 II. MATERIALES Y MÉTODOS 17 2.1. 237 2.2. ¡Error! Marcador no definido. 2.3. ¡Error! Marcador no definido.8 2.4. ¡Error! Marcador no definido.2.5. ¡Error! Marcador no definido.9 2.6. ¡Error! Marcador no definido.22 2.7. ¡Error! Marcador no definido.22 III. RESULTADOS 23 IV. DISCUSIÓN 27 4.1. ¡Error! Marcador no definido.7 4.2. ¡Error! Marcador no definido.31 4.3. ¡Error! Marcador no definido.32 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 33 ANEXOS 38 ANEXO A: Instrumentos de recolección de datos 38 ANEXO B: Matriz de consistencia 39 ANEXO C: Operacionalización de las variables 41 ANEXO D: Certificado de análisis de la cepa ATCC 45 ANEXO E: Identificación taxonómica de Origanum vulgare L. (ORÉGANO)47 ANEXO F: Certificado de calidad del aceite esencial de Cinnamomun Zeylanicum Blume (CANELA) 48 4 ANEXO G: Protocolo de conservación de los aceites esenciales 49 ANEXO H: Evidencias fotográficas del trabajo de campo 50 5 ÍNDICE DE TABLAS Páginas Tabla 1. Estadística descriptiva de los datos recolectados para Cinnamomun Zeylanicum Blume (CANELA) Y Origanum Vulgare L. (ORÉGANO) frente a Streptococcus mutans ATCC 25175 23 Tabla 2. Análisis de la varianza (ANOVA) 24 Tabla 3. Análisis por subgrupos homogéneos mediante la prueba de Tukey 25 Tabla 4. Sensibilidad antibacteriana según la escala de Duraffourd 26 Tabla 5. Prueba de distribución normal 43 Tabla 6. Prueba de homogeneidad de varianzas (Levene) 44 6 ÍNDICES DE FIGURAS Páginas Figura 1.Diámetro promedio de los halos de inhibición por grupo de trabajo 42 Figura 2.Recolección de Origanum vulgare L. (Orégano) 50 Figura 3. Selección y separación de las hojas 52 Figura 4. Instalación del equipo de destilación por arrastre con vapor 51 Figura 5. Obtención del aceite esencial de Origanum vulgare L. (Orégano) 52 Figura 6. Decantación del aceite esencial 53 Figura 7. Preparación de las concentraciones de los aceites esenciales 53 Figura 8. Activación de la cepa 54 Figura 9. Elaboración de pozos en agar 54 Figura 10. Aplicación de los aceites en el medio de cultivo 55 Figura 11. Medición del halo de inhibición 55 7 RESUMEN Objetivo: Demostrar la actividad antibacteriana de la mezcla de aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans ATCC 25175 Material y Método: El estudio presentó enfoque cuantitativo, con diseño experimental y tipo prospectivo y transversal, la población de estudio estuvo conformada por las especies vegetales de Cinnamomun Zeylanicum Blume (canela) y Origanum Vulgare L. (orégano), la muestra empleada fue el aceite esencial de ambas especies, el aceite de orégano fue obtenido mediante la técnica de arrastre con vapor y mediante el método de difusión en pozo se determinó la actividad antibacteriana. Resultados: Los resultados mostraron halos de inhibición promedio con respecto al aceite de canela al 50%, 75% y 100% fue de 31,10 + 0,31mm, 38,23 + 0,36mm y 42,95 + 0,31mm respectivamente; el aceite de orégano al 50%, 75% y 100% fue de 25,99 + 0,44mm, 32,64 + 0,30mm y 36,86 + 0,36mm respectivamente; la mezcla de los aceites de canela y orégano al 50%, 75% y 100% fue de 29,35 + 0,50mm, 34,84 + 0,41mm y 40,11 + 0,51mm respectivamente y el control negativo obtuvo halos de inhibición de 6,17 + 0,41mm. Conclusiones: La mezcla de aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) presentó actividad antibacteriana Palabras clave: Cinnamomum zeylanicum, Origanum vulgare, Streptococcus mutans, aceite esencial, antibacteriano. 8 ABSTRACT Objective: To demonstrate the antibacterial activity of the essential oil mixture of Cinnamomum zeylanicum Blume (cinnamon) and Origanum vulgare L. (oregano) against Streptococcus mutans ATCC 25175. Material and method: The study presented a quantitative approach, with an experimental design and prospective and cross-sectional type, the study population was made up of the plant species of Cinnamomun Zeylanicum Blume (cinnamon) and Origanum Vulgare L. (oregano), the sample used was the essential oil from both species, the oregano oil was obtained by the steam drag technique and the antibacterial activity was determined by the well diffusion method. Results: The results showed average inhibition halos with respect to cinnamon oil at 50%, 75% and 100% was 31.10 + 0.31mm, 38.23 + 0.36mm and 42.95 + 0.31mm respectively. ; oregano oil at 50%, 75% and 100% was 25.99 + 0.44mm, 32.64 + 0.30mm and 36.86 + 0.36mm, respectively; the mixture of cinnamon and oregano oils at 50%, 75% and 100% was 29.35 + 0.50mm, 34.84 + 0.41mm and 40.11 + 0.51mm respectively and the negative control obtained halos inhibition of 6.17 + 0.41mm. Conclusions: The essential oil mixture of Cinnamomum zeylanicum Blume (cinnamon) and Origanum vulgare L. (oregano) showed antibacterial activity Keywords: Cinnamomum zeylanicum, Origanum vulgare, Streptococcus mutans, essential oil, antibacterial 9 I. INTRODUCCIÓN Streptococcus mutans es una bacteria anaerobia Gram positiva residente en la cavidad bucal y vías respiratorias altas; así mismo, se comporta como patógeno oportunista en la caries dental y endocarditis infecciosa, presenta mecanismos patogénicos como el poder acidogénico, acidófilo y acidúrico, además de su adhesión a las proteínas salivales, hace que su capacidad infectiva sea un problema de salud a nivel mundial con altos índices de morbilidad 1,2. La caries dental es una de las enfermedades más comunes causadas por Streptococcus mutans a nivel mundial; sin embargo, también existe una alta incidencia de casos de endocarditis presentando de 15 a 30 casos por cada millón de habitantes al año, aunque esta tasa ha disminuido en los últimos años, pero aún presenta graves problemas de salud pública a nivel mundial 3,4. El Centro para la Prevención y Control de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC) indicó que las bacterias que presentan resistencia producen 2´000,000 de infecciones y 23,000 muertes en los Estados Unidos de América, probablemente esta cifra sea igual a la realidad en los países de América Latina. En el Perú se muestra una realidad similar a todo el mundo por ello es de vital importancia tomar en consideración las medidas útiles de prevención y promoción a dicho problema relacionado a la salud bucodental. El Ministerio de Salud (MINSA) informó que el 90.4 % de peruanos tienen caries dentaria y un 85 % padece de enfermedades periodontales, donde indican que los malos hábitos de higiene bucal son una de las causas principales de salud pública 5,6. 10 El presente proyecto de investigación tomando en consideración la problemática y las potenciales propiedades que pueden presentar estas dos especies, se plantea la siguiente pregunta general: - ¿Presentará actividad antibacteriana la mezcla de aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans ATCC 25175?, del mismo modo se plantearon las siguientes preguntas secundarias, Preguntas específicas - ¿Cuál será la actividad antibacteriana del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) al 100% ,75% y 50% frente a Streptococcus mutans?, - ¿Cuál será la actividad antibacteriana del aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano) al 100%, 75% y 50% frente a Streptococcus mutans?, - ¿Cuál de los aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) presentará mayor actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans? y - ¿Presentará actividad antibacteriana sinérgica los aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans? Cinnamomum zeylanicum es un árbol que alcanza casi los 9 m de alto, crece en zonas tropicales. Está comprobado científicamente que algunos de sus compuestos presentan determinadas acciones como el cinamaldehido componente principal del aceite esencial, responsable del olor y sabor de la corteza de la canela es hipotensor, espasmolítico y antiinflamatorio, el aceite y extractos de la corteza presenta actividad antimicrobiana y el aceite de las hojas es anestésico y antiséptico, otros compuestos importantes tenemos al eugenol, ácido cinámico y cinamato 7. 11 Con respecto a Origanum vulgare es una planta herbácea, perenne, sus tallos son rectos, miden 90 cm o más, presenta ramificaciones. Sus hojas son ovaladas, enteras o ligeramente serradas. Destacada por sus propiedades farmacológicas como antimicrobiano, antiviral, antioxidante, antiinflamatorio, antiespasmódico, neuroprotector, etc. Su aceite esencial está compuesto principalmente de fenoles (timol y carvacrol), p-cimeno y γ-terpinene, acetato de linalilo, β-cariofileno. Linalol, trans-cariofileno y el sabineno. Siendo el carvacrol el componente principal 8. 12 Entre los antecedentes internacionales: Husain I., et al (2018), quienes determinaron la actividad apoptótica y antibacteriana del extracto etanólico de Cinnamomum zeylanicum (canela). Los resultados encontrados mostraron que Cinnamomum zeylanicum (canela) no presenta actividad antibacteriana significativa contra Escherichia coli; sin embargo, si la presenta contra Staphylococcus aureus a concentraciones de 10 mg/mL 9. Por su parte, Wang Y., et al (2018), determinaron su efecto antibacteriano del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) y cinamaldehído contra Porphyromonas gingivalis. En los resultados las concentraciones mínimas de inhibición de C. zeylanicum y cinamaldehído fueron de 6.25 µg/ml y 2.5 µM para P. gingivalis, respectivamente 10. Ortega A., (2018), determinó el efecto antibacteriano de los aceites esenciales de Origanum vulgare (orégano) y Thymus vulgaris (tomillo) contra la cepa bacteriana Staphylococcus aureus ATCC 2600 a concentraciones del 10%, 25%, 50%, 75% y 100%. Los halos de inhibición obtenidos en los resultados fueron de 32.5 mm para el orégano y 33 mm para el tomillo, ambos a las concentraciones del 100%; para el aceite de Origanum vulgare (orégano) la CMI fue de 0.12% y para el aceite de T. vulgaris fue de 0.25% 11. 13 Entre los antecedentes nacionales: Layme M., (2019), quien determinó el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum B. y Origanum vulgare L. frente a E. faecalis y Candida albicans; mostrando su actividad antibacteriana a partir de las concentraciones, 14,06 mg/ml para ambas bacterias, 15,17 mg/ml en Origanum vulgare L. y 16,61 mg/ml muy sensibles en la mezcla de los aceites; con respecto al efecto antimicótico contra Candida albicans fue muy sensible a 19,98 mg/ml para Cinnamomum zeylanicum B. y en 26,71 mg/ml para Origanum vulgare L.,este hongo resulta ser muy sensible a la unión de ambos aceites en 17,44 mg/ml 12. Ruiz F., (2019), evaluó el efecto antibacteriano del aceite esencial de Origanum vulgare contra Salmonella typhi, a concentraciones de 5%, 25%, 50%, 75% y 100%. En los resultados se halló que Salmonella typhi es altamente sensible al aceite esencial de Origanum vulgare al 75% y 100%; muy sensible al 25% y 50% y sensible al 5%, siendo las concentraciones del 75% y 100% significativamente mayor al ciprofloxacino contra esta bacteria 13. Luis A.,(2017), determinó la actividad antibacteriana del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) comparado con clorhexidina al 0,12% frente a Streptococcus mutans. Como resultado mostró estabilidad y eficacia antibacteriana in vitro del aceite sobre S. mutans a las 72 horas y 120 horas, no obstante, la clorhexidina presentó mayor actividad que el aceite a las 120 horas 14. 14 La importancia de este estudio se basa en aportar información sobre la eficacia bacteriana de dos plantas medicinales, en asociación y su efecto comparado lo que brindará un nuevo conocimiento a futuros trabajos de investigación que se respalden en este estudio. Por otro lado, este estudio servirá como base para la comunidad científica para seguir realizando estudios acerca de estas especies vegetales, con el fin de demostrar más efectos terapéuticos. La justificación del presente estudio, se fundamenta en la problemática que se presenta sobre la resistencia bacteriana a nivel local y mundial, así mismo, sobre el tipo de enfermedad que produce Streptococcus mutans, en tal sentido, es necesario investigaciones que ayuden a mejorar los tratamientos y combatir la resistencia bacteriana que ocasiona altos costos por tratamiento en la población, los beneficios del estudio permitirán reducir estos costos, brindar una mejor calidad de vida a las personas, disminuir días de hospitalización y sobre todo reducir los índices de resistencia bacteriana de esta bacteria. Por lo tanto, el presente estudio tiene como objetivo general, demostrar la actividad antibacteriana de la mezcla de aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans ATCC 25175, a partir de este se han formulado los siguientes objetivos específicos. − Determinar la actividad antibacteriana del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum B (canela) al 100%, 75% y 50% frente a Streptococcus mutans. − Identificar la actividad antibacteriana del aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano) al 100%, 75% y 50% frente a Streptococcus mutans. − Comparar la actividad antibacteriana del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans. − Examinar la actividad antibacteriana sinérgica de aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans. 15 Como hipótesis general, la mezcla de los aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) presentan actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans ATCC 25175, en cuanto a las hipótesis específicas planteadas tenemos: − El aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) al 100%, 75% y 50% presenta actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans. − El aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano) al 100%, 75% y 50% presenta actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans. − El aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) posee mejor actividad antibacteriana que el aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans. − Existe efecto sinérgico antibacteriano entre los aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans. 16 II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Enfoque y diseño de la investigación Enfoque cuantitativo: Se emplearon los datos recolectados en el estudio para realizar un procesamiento estadístico que demuestre la hipótesis del estudio con confianza 15. Diseño experimental: En el estudio se manipuló o alteró las variables de estudio de sus condiciones normales para demostrar la hipótesis del estudio 16. Tipo de investigación: Transversal y Prospectivo. Es transversal: Dado que la recolección de los datos se llevó a cabo en un solo periodo de tiempo 17. Es prospectivo: Debido a que los datos de las experimentaciones realizadas fueron recolectados como vayan sucediendo 17. 2.2. Población, muestra y muestreo Población La población de estudio está conformada por la especie vegetal de Cinnamomum zeylanicum B. (canela) obtenida por servicio de la capital de Lima (Ver Anexo F - G). Y Origanum vulgare L. (orégano) fue recolectado en el distrito de Monsefú, ubicado a 15 km de la provincia de Chiclayo, departamento de Lambayeque. La cepa Streptococcus mutans ATCC 25175, fue proporcionada por el laboratorio Microclin de la ciudad de Trujillo. 17 Muestra La muestra de estudio está conformada por 4 kilogramos de hoja de Origanum vulgare L. (orégano) y 10 ml de aceite esencial Cinnamomum zeylanicum B. (canela). Y como muestra microbiológica tenemos a Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de cepas Streptococcus mutans ATCC 25175 a escala de Mc Farland 0.5. Muestreo El tipo de muestreo fue no probabilístico por conveniencia, debido a no ser un muestreo aleatorizado, se obtuvo las muestras de un lugar determinado en atención a la facilidad y disponibilidad de acceso del investigador para su recolección 18. 2.3. Variables de investigación Variable independiente: Aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano). Definición conceptual: Se refiere a la solución oleosa de naturaleza aromática que contienen metabolitos activos al 50%, 75% y 100% del aceite de canela y orégano 19. Definición operacional: Elaborado mediante el método de destilación con arrastre de vapor 19. Variable dependiente: Actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans. Definición conceptual: Se refiere al poder de inhibir o reducir el crecimiento de la bacteria 20. Definición operacional: Por medio de las pruebas de ANOVA Y TUKEY para la contrastación de la hipótesis de estudio se compararán los diámetros de los halos de inhibición 20. 18 2.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos Destilación de arrastre por vapor: Técnica que emplea el vapor de agua, el cual se extrae de la muestra vegetal de los aceites esenciales para luego ser sometido a condensación y separación posterior 21. Difusión en pozo: Método estandarizado para determinar la sensibilidad o actividad antibacteriana de una sustancia sometiéndola a cultivos de bacterias sobre un pozo en agar 20. Vernier digital: Instrumento de medida de alta precisión empleado para obtener datos de longitudes pequeñas. 2.5. Plan metodológico para la recolección de datos ● Autorización y coordinaciones previas La clasificación taxonómica de la especie vegetal en estudio fue realizada por un especialista botánico de la ciudad de Lima, emitiendo una constancia de identificación taxonómica y los procedimientos microbiológicos se realizaron en las instalaciones del Laboratorio Microclin LTDA, el mismo que proporcionó las cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175. ● Recolección de la muestra Los investigadores se trasladaron al lugar de recolección de la muestra Origanum vulgare L. (orégano), previa coordinación con el propietario del área de cultivo ubicado en el distrito de Monsefú, Chiclayo-Lambayeque Latitud: -6.87861, Longitud: -79.8167, altitud 13 msnm. Luego se procedió a la recolección de la muestra vegetal, en las primeras horas de la mañana en cantidad suficiente obteniendo 4 kilogramos de hojas aproximadamente. Asimismo, se tomó una muestra representativa de 19 cada especie para que el profesional botánico pueda identificar y describir taxonómicamente a las especies vegetales. Las muestras recolectadas se colocaron sobre papel Kraft y se trasladaron al laboratorio para el inicio de su procesamiento. ● Acondicionamiento y preparación de la muestra 22 De las muestras vegetales obtenidas se seleccionaron aquellas que presentaron las mejores características de conservación, frescura según criterios de inclusión y exclusión. ● Obtención del aceite esencial 23 Las hojas de origanum vulgare L. (ORÉGANO) fueron colocadas sobre el soporte del equipo de arrastre por vapor en una cantidad de 500 gr, luego se procedió a armar el equipo asegurando las líneas de agua para el refrigerante, colocando 10 litros de agua en el equipo y sellando para mantener hermético el equipo, el procedimiento se realizó cada 4 horas donde se cambió por nueva muestra hasta agotar la muestra. El aceite esencial de las hojas de Cinnamomun zeylanicum B. (CANELA) se obtuvo de forma comercial de la empresa Essential Oils Perú (EOP), evidenciando el método de destilación por arrastre de vapor (ver anexo F). ● Obtención y reactivación de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175: 21 La cepa de estudio (Streptococcus mutans ATCC 25175) fue proporcionada por el Laboratorio microbiológico Microclin S.A. de la ciudad de Trujillo el cual nos brindó las facilidades para la elaboración de los análisis. 20 Para la reactivación de la cepa de estudio se mezcló la ampolla que contiene el microorganismo liofilizado y se mezcló con este contenido, luego de esto se combinó por 5 minutos y se realizó un sembrado en estrías en el medio de cultivo Agar Sangre de Cordero, luego se llevó a incubación en medio anaeróbico (jarra de anaerobiosis) por 24 horas a 37°C, al no encontrar crecimiento en este periodo de tiempo se llevó nuevamente a incubación por 24 horas más. ● Sembrado en placa de cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175: 21,24 Una vez obtenidas las colonias del microorganismo, se tomaron de estas dos asadas con un hisopo estéril y se diluyó hasta obtener 0.5 en la escala de Mc. Farland comparado con el estándar de Mc Farland mediante diluciones sucesivas con agua destilada. De este último, se realizó sembrados en superficie en agar Müller Hinton con un hisopo estéril en placas Petri. ● Evaluación del efecto antibacteriano 25 Se realizaron pozos de un diámetro de 6 mm en las placas sembradas y luego se aplicaron 30 uL de las distintas concentraciones en los pozos realizados empleando una placa para las concentraciones experimentales según tamaño del halo producido. Las muestras se incubaron en anaerobiosis por 24 horas a 37°C. Luego de esto se procedió a tomar las medidas directas de los halos de inhibición formados con un vernier digital. 21 2.6. Procesamiento del análisis estadístico Los datos recolectados del tamaño del halo de inhibición formado,fueron procesados mediante estadística descriptiva y posteriormente pruebas inferenciales para la contrastación de la hipótesis de estudio, como ANOVA y Tukey mediante el programa estadístico SPSS versión 26, con un nivel de confianza del 95%. 2.7. Aspectos éticos Debido a ser un estudio experimental in vitro, no requirió evaluación del Comité de Ética; sin embargo, por manejar microorganismos con capacidad infectiva se cumplió las Buenas Prácticas de Laboratorio y la disposición de los desechos considerados Biocontaminados 26,27. 22 III. RESULTADOS Tabla 1. Estadística descriptiva de los datos recolectados para Cinnamomun Zeylanicum Blume (CANELA) Y Origanum Vulgare L. (ORÉGANO) FRENTE A Streptococcus mutans ATCC 25175 Diámetro del halo de inhibición (mm) 95% Intervalo de confianza Desv. Error Medi para la Media Mínim Máxim N Estánda Estánda a Límite Límite o o r r inferior superior Aceite de canela - 1 31,10 0,31 0,08 30,93 31,28 30,56 31,59 50% 5 Aceite de canela - 1 38,23 0,36 0,09 38,03 38,43 37,69 39,20 75% 5 Aceite de canela - 1 42,95 0,31 0,08 42,78 43,12 42,32 43,37 100% 5 Aceite de orégano - 1 25,99 0,44 0,11 25,74 26,23 25,19 26,72 50% 5 Aceite de orégano - 1 32,64 0,30 0,08 32,48 32,81 32,22 33,20 75% 5 Aceite de orégano - 1 36,86 0,36 0,09 36,66 37,06 36,18 37,45 100% 5 Aceite de canela + 1 29,35 0,50 0,13 29,07 29,62 28,52 30,27 orégano - 50% 5 Aceite de canela + 1 34,84 0,41 0,11 34,61 35,07 34,19 35,39 orégano - 75% 5 Aceite de canela + 1 40,11 0,51 0,13 39,83 40,40 39,19 41,60 orégano - 100% 5 1 Control negativo 6,17 0,41 0,03 6,11 6,23 6,05 6,40 5 Fuente: SPSS ver. 26 La tabla 1 se puede apreciar el análisis realizado a todos los grupos de datos con respecto al tamaño del halo de inhibición obtenidos sobre cultivos en placa de Streptococcus mutans ATCC 25175, se evaluó la media, desviación estándar, los 23 límites de confianza y valores máximo y mínimo encontrados los halos de inhibición promedio con respecto al aceite de canela al 50%, 75% y 100% fue de 31,10 + 0,31 mm, 38,23 + 0,36 mm y 42,95 + 0,31 mm respectivamente; el aceite de orégano al 50%, 75% y 100% fue de 25,99 + 0,44mm, 32,64 + 0,30mm y 36,86 + 0,36mm respectivamente; la mezcla de los aceites de canela y orégano al 50%, 75% y 100% fue de 29,35 + 0,50mm, 34,84 + 0,41mm y 40,11 + 0,51mm respectivamente y el control negativo obtuvo halos de inhibición de 6,17 + 0,41mm Tabla 2. Análisis de la varianza (ANOVA) Diámetro del halo de inhibición Suma de cuadrados df Media al cuadrado F p-valor. Entre grupos 14514,587 9 1612,732 11311,732 0,000 Dentro de grupos 19,960 140 0,143 Total 14534,547 149 Fuente: SPSS ver. 26 La tabla 2 muestra la prueba de ANOVA o análisis de la varianza aplicado a los grupos de los datos mediante el programa SPSS versión 26, luego del análisis se observa un p-valor obtenido menor al nivel de significancia del estudio; por lo tanto, la prueba nos confirma que existe diferencia estadísticamente significativa en al menos uno de los grupos de datos analizados. 24 Tabla 3. Análisis por sub grupos homogéneos mediante la prueba de Tukey HSD Tukeya Grupos de trabajo N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Control negativo 15 6,17 Aceite de orégano - 15 25,99 50% Aceite de canela + 15 29,35 orégano - 50% Aceite de canela - 15 31,10 50% Aceite de orégano - 15 32,64 75% Aceite de canela + 15 34,84 orégano - 75% Aceite de orégano - 15 36,86 100% Aceite de canela - 15 38,23 75% Aceite de canela + 15 40,11 orégano - 100% Aceite de canela - 15 42,95 100% Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 15,000. Fuente: SPSS ver. 26 La tabla 3, muestra un análisis complementario a la prueba de ANOVA el cual se realizó mediante la prueba de Tukey por sub grupos homogéneos, que nos permite determinar y comparar los grupos de datos, en este análisis se determinó diferencias estadísticamente significativas entre todos los grupos de los datos analizados, demostrando que todos los tratamientos presentan efectos diferentes. 25 Tabla 4. Sensibilidad antibacteriana según la escala de Duraffourd Altamente Sensibilidad nula Sensible Muy sensible Tratamiento sensible < 8 mm 8–14 mm 14-20 mm > 20 mm Control negativo 6,17 Aceite de orégano - 50% 25,99 Aceite de canela + orégano - 29,35 50% Aceite de canela - 50% 31,10 Aceite de orégano - 75% 32,64 Aceite de canela + orégano - 34,84 75% Aceite de orégano - 100% 36,86 Aceite de canela - 75% 38,23 Aceite de canela + orégano - 40,11 100% Aceite de canela - 100% 42,95 En la tabla 4, se representan los halos promedios obtenidos por los grupos de tratamiento y control y se comparan mediante la escala de Duraffourd, se puede apreciar que Streptococcus mutans ATCC 25175 presenta Sensibilidad Nula al grupo control negativo y es altamente sensible a todos los aceites de Cinnamomun zeylanicum Blume (canela) Y Origanum Vulgare L. (orégano) a las concentraciones del 50%, 75%, 100% y la mezcla de estos. 26 IV. DISCUSIÓN 4.1. Discusión de Resultados La presente investigación evaluó la actividad antibacteriana in vitro de dos tipos de aceites esenciales, el aceite esencial comercial, de Zeylanicum Blume (canela) obtenido como muestra comercial marca EOP de la empresa Essential Oils Perú SAC y el aceite esencial de Origanum vulgare (orégano) obtenido por medio de la técnica de destilación por arrastre de vapor; así mismo, se evaluó la mezcla de ambos aceites esenciales frente a Streptococcus mutans ATCC 25175. Los resultados obtenidos en el estudio se detallan a continuación. En la tabla 1 los valores obtenidos por los aceites esenciales sobre cultivos en placa de Streptococcus mutans ATCC 25175, mostraron halos de inhibición promedio con respecto al aceite de C. Zeylanicum B. (canela) al 50% 31,10 + 0,31mm; al 75 % 38,23 + 0,36mm y al 100% 42,95 + 0,31mm respectivamente ; sin embargo con el aceite de Origanum vulgare L. (orégano) se obtuvieron 25,99 + 0,44mm al 50%; 32,64 + 0,30mm al 75% y al 100% fue de 36,86 + 0,36mm respectivamente; en la mezcla de los aceites de Zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) obtuvieron halos de 29,35 + 0,50mm al 50%; 34,84 + 0,41mm al 75% y al 100% 40,51 + 0,31mm respectivamente y el control negativo obtuvo halos de inhibición de 6,17 + 0,41mm. Los datos recolectados se sometieron al análisis de distribución normal mediante las pruebas de Kolmogorov Smirnov y Shapiro Wilk, obteniendo en ambos casos un p > 0.05, confirmando la hipótesis alterna que demuestra de los datos analizados corresponden a una distribución normal (ver anexo tabla 5), posteriormente se realizó la prueba de Levene o de homogeneidad de varianza, resultando del mismo modo, un p > 0,05, lo que confirma que los datos analizados corresponden a varianzas homogéneas (ver anexo tabla 6). 27 Así mismo, las pruebas inferenciales de ANOVA tabla 2 nos permitió determinar la existencia de grupos de datos estadísticamente diferentes en función del halo promedio; así mismo, la prueba de TUKEY tabla 3 nos ayudó a determinar cuáles de los grupos de datos presentaban diferencias estadísticamente significativas en sus actividades antibacterianas relacionadas al halo de inhibición, los valores de los resultados se calcularon con un nivel de significancia del 0.05. En la tabla 4 muestra la sensibilidad antibacteriana mediante la escala de Duraffourd, se representan los halos promedios obtenidos por los grupos de tratamiento y control, luego se comparan, donde se aprecia que Streptococcus mutans ATCC 25175 presenta Sensibilidad Nula al grupo control negativo 6.17mm y es altamente sensible a todos los aceites de Cinnamomun zeylanicum Blume (canela) Y Origanum Vulgare L. (orégano) a las concentraciones del 50%, 75%, 100% y la mezcla de estos. Wang Y. et. al. (2018) 10, evaluaron el efecto antibacteriano del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) contra Porphyromonas gingivalis. En su estudio encontraron efecto antibacteriano contra esta bacteria a la concentración mínima de 6.25 µg/ml. Los resultados encontrados por Wang Y. et. al. al igual que nuestro estudio confirman la acción antibacteriana que presenta el aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) con una concentración mínima de 42.32mm; así mismo, indica que el efecto antibacteriano de esta planta se debe al metabolito cinamaldehído presente en altas concentraciones en el aceite de Cinnamomum zeylanicum (canela), por otro lado, se dilucidó que el efecto se debe a la fuga del ácido nucleico y proteínas, así como el deterioro de la permeabilidad celular que este aceite produce sobre el microorganismo. Por otra parte,en los estudios realizados con respecto a Origanum vulgare (orégano) el investigador Ortega A. (2018) 11, comparó este aceite contra la cepa bacteriana Staphylococcus aureus ATCC 2600 a las concentraciones 28 del 10%, 25%, 50%, 75% y 100% encontrando halos de inhibición a la máxima concentración de 32.5mm determinando de esta manera el efecto antibacteriano contra esta bacteria. Estos resultados del mismo modo, se observan similares, aunque en diferente bacteria cuando se compara la acción de Origanum vulgare (orégano) sobre Staphylococcus aureus con halo de inhibición de 32.5mm y sobre Streptococcus mutans con halo de inhibición de 36,86 mm, por lo tanto, se puede decir que el aceite esencial de Origanum vulgare (orégano) presenta similar efecto sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans. Por otro lado, Layme M. (2019) 12, determinó el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum B. y Origanum vulgare L. frente a E. faecalis y Candida albicans encontrando efecto antibacteriano contra E. faecalis por parte del aceite de Cinnamomum zeylanicum B. a partir de la concentración de 14,06 mg/ml; y a la concentración de 15,17 mg/ml para Origanum vulgare L.; con respecto al efecto antimicótico contra Candida albicans este se observó a partir de la concentración de 19,98 mg/ml para Cinnamomum zeylanicum B. y a la concentración de 26,71 mg/ml para Origanum vulgare L, la unión de ambos aceites presentó efecto inhibitorio a partir de la concentración de 17,44 mg/ml. Los valores obtenidos de la desviación estándar, se muestran elevadas en comparación al nuestro; sin embargo, el número de repeticiones son 8 en comparación con el de nosotros que es de 15, razón que puede haber modificado la exactitud o precisión en la recolección de los datos. El estudio refiere que el autor solo realizó un análisis de los datos por observación directa pero no aplicó pruebas inferenciales para determinar las diferencias de los grupos de datos. 29 − Por su parte Luis A., (2017) 14, determinó la actividad antibacteriana del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) comparado con clorhexidina al 0,12% sobre Streptococcus mutans; encontrando actividad antibacteriana del aceite de Cinnamomum zeylanicum (canela) hasta las 120 horas con un diámetro de inhibición promedio de 36,22 mm, y una desviación estándar de 5,6; estos valores se muestran superiores a los encontrados en el estudio, superando los valores de variación de la desviación estándar, además la prueba estadística empleada difiere de la nuestra, se empleó para el análisis la prueba T-Student (p 1,00) para la comparación de dos grupos a las 72 horas y 120 horas. Los resultados del estudio se observan similares, al comparar el valor promedio del halo de inhibición del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) que fue de 36,22mm, con el valor promedio obtenidos en nuestro estudio, de 42,95 + 0,31 sobre la misma bacteria; por otro lado, hay que remarcar las diferencias en cuanto al tiempo de toma de datos; motivo que puede explicarse las leves variaciones en el tamaño del halo de inhibición. Los estudios antes citados se correlacionan con los resultados obtenidos, en función de la actividad antibacteriana que presentan ambos aceites contra diferentes tipos de bacterias, sin embargo, no se encontraron estudios que hayan evaluado su actividad en conjunto, en tal sentido, los resultados encontrados en nuestra investigación corroboran la actividad antibacteriana de los aceites de Cinnamomum zeylanicum Blume y Origanum vulgare L. de manera independiente frente a Streptococcus mutans ATCC 25175, así mismo, determinó la actividad antibacteriana de la mezcla de estos aceites observando que no muestran un efecto sinérgico y actuarían de manera independiente contra Streptococcus mutans ATCC 25175, estos resultados fueron analizados en función del halo promedio obtenido y mediante las pruebas estadísticas de ANOVA y TUKEY con un nivel alfa del 0.05. 30 4.2. Conclusiones − La mezcla de aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) presentaron actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans ATCC 25175. − La actividad antibacteriana del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) al 50%, 75% y 100% frente a Streptococcus mutans fue demostrada con la formación de halos de inhibición de 31,10 + 0,31 mm, 38,23 + 0,36 mm y 42,95 + 0,31 mm respectivamente. − La actividad antibacteriana del aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano) al 50%, 75% y 100% frente a Streptococcus mutans fue demostrada con la formación de halos de inhibición de 25,99 + 0,44 mm, 32,64 + 0,30mm y 36,86 + 0,36 mm respectivamente. − El aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) presenta halos de inhibición promedio de 42,95 + 0,31 mm mostrando mayor actividad antibacteriana que Origanum vulgare L. (orégano) con halos de inhibición promedio de 36,86 + 0,36 mm frente a Streptococcus mutans. − No se observó la presencia de la actividad antibacteriana sinérgica de los aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare L. (orégano) frente a Streptococcus mutans. 31 4.3. Recomendaciones − Es necesario identificar por métodos analíticos el metabolito secundario que produce el efecto antibacteriano en ambas especies vegetales para potenciar su acción. − Se recomienda realizar estudios de estas especies vegetales en formulaciones farmacéuticas que sirvan en tratamientos complementarios para infecciones por Streptococcus mutans. − Promover el uso de estas especies vegetales en el tratamiento de infecciones o medicina alternativa en el Sector de Salud. − Determinar la actividad antibacteriana sinérgica de las especies vegetales en estudio con medicamentos. 32 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Lemos J, Palmer S, Zeng L, Wen Z, Kajfasz J, Freires I, et al. 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(ORÉGANO) 50% 75% 100% 50% 75% 100% 50% 75% 100% Control (-) 1 31,09 38,13 43,15 26,22 32,63 36,92 29,45 34,87 40,10 6,15 2 31,56 38,27 43,34 25,85 32,39 37,02 29,02 34,45 40,06 6,25 3 30,86 38,02 43,17 26,32 32,22 37,07 28,54 35,23 41,60 6,07 4 31,32 38,18 43,37 26,72 33,20 36,28 29,45 34,29 39,78 6,26 5 30,73 38,19 43,05 26,17 33,13 37,45 28,52 34,32 39,75 6,05 6 31,38 38,65 42,32 25,69 32,36 36,77 29,96 35,32 40,25 6,26 7 31,16 37,69 42,90 26,01 32,59 36,70 29,43 35,13 39,91 6,40 8 30,56 38,17 42,95 26,49 32,69 36,87 29,80 34,98 40,48 6,05 9 31,32 37,78 42,54 25,19 32,32 36,69 29,41 34,54 40,12 6,16 10 31,59 38,15 42,92 25,53 32,54 37,26 30,27 34,86 40,24 6,08 11 31,28 38,29 43,07 26,21 32,84 37,32 29,03 34,19 40,02 6,34 12 30,94 38,34 42,59 25,71 32,42 36,18 28,87 35,39 39,19 6,07 13 31,18 39,20 42,94 25,27 32,61 36,95 29,35 34,88 39,89 6,13 14 30,71 38,01 42,66 26,42 33,08 36,47 29,82 35,39 40,02 6,15 15 30,88 38,39 43,30 26,02 32,62 36,96 29,28 34,75 40,31 6,11 38 Anexo B. Matriz de consistencia ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro DE LA MEZCLA DE ACEITES ESENCIALES DE Cinnamomum Zeylanicum Blume (CANELA) Y Origanum Vulgare L. (ORÉGANO) FRENTE A Streptococcus mutans ATCC 25175 Formulación del problema Objetivos Hipótesis Problema General Objetivo General Hipótesis General Presentará actividad antibacteriana la mezclaDemostrar la actividad antibacteriana de laLa mezcla de los aceites esenciales de de aceite esencial de Cinnamomummezcla de aceite esencial de CinnamomumCinnamomum zeylanicum Blume (canela) y zeylanicum Blume (canela) y Origanumzeylanicum Blume (canela) y OriganumOriganum vulgare L. (orégano) presentan vulgare L. (orégano) frente a Streptococcusvulgare L. (orégano) frente a Streptococcusactividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans ATCC 25175 mutans ATCC 25175 mutans ATCC 25175 Problemas Específicos Objetivos Específicos Hipótesis Específicas ¿Cuál será la actividad antibacteriana del Determinar la actividad antibacteriana del El aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) al 100%, 75% y 50% presenta Blume (canela) al 100% y 50% frente a Blume (canela) al 100%, 75% y 50% frente a actividad antibacteriana frente a Streptococcus Streptococcus mutans? Streptococcus mutans. mutans ¿Cuál será la actividad antibacteriana del Identificar la actividad antibacteriana del El aceite esencial de Origanum vulgare L. aceite esencial de Origanum vulgare L. aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano) al 100%, 75% y 50% presenta (orégano) al 100% y 50% frente a (orégano) al 100%, 75% y 50% frente a actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans Streptococcus mutans? Streptococcus mutans. 39 ¿Cuál de los aceites esenciales de El aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Comparar la actividad antibacteriana del Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Blume (canela) posee mejor actividad aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Origanum vulgare L. (orégano) presentará antibacteriana que el aceite esencial de Blume (canela) y Origanum vulgare L. mayor actividad antibacteriana frente a Origanum vulgare L. (orégano) frente a (orégano) frente a Streptococcus mutans. Streptococcus mutans? Streptococcus mutans ¿Presentará actividad antibacteriana Examinar la actividad antibacteriana Existe efecto sinérgico antibacteriano entre los sinérgica los aceites esenciales de sinérgica de los aceites esenciales de aceites esenciales de Cinnamomum Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) y zeylanicum Blume (canela) y Origanum vulgare Origanum vulgare L. (orégano) frente a Origanum vulgare L. (orégano) frente a L. (orégano) frente a Streptococcus mutans. Streptococcus mutans? Streptococcus mutans 40 Anexo C. Operacionalización de las variables VARIABLES DEFINICIÓN DEFINICIÓN ESCALA DE N° DECONCEPTUAL OPERACIONAL DIMENSIONES INDICADORES MEDICIÓN ÍTEMS VALOR Aceites esenciales de Cinnamomum Solución oleosaobtenida de lasObtención por 100 zeylanicum medio de Blume (canela)plantas conpropiedades destilación con Concentraciones 75 Ordinal 3 % y Origanumaromáticas arrastre de vapor 50vulgare L. (orégano) ≤ 8mm Actividad Nula antibacteriana Inhibición en el Por medio de la crecimiento detécnica se Sensiblefrente aStreptococcus compararán los Diámetro del halo de inhibición 8mm a 14mm 15mm Ordinal 4Streptococcus Medio mutans mutans. diámetros de los halos de inhibición. a 20mm Muy sensible ˃ a 20mm 41 Figura: 1. Diámetro promedio de los halos de inhibición por grupo de trabajo Fuente: SPSS ver. 26 La figura 1 se observa de manera visual el comportamiento del efecto antibacteriano según el tamaño de halo de inhibición formado de los grupos de tratamientos y grupo control negativo, se puede apreciar que existe mayor efecto antibacteriano en el aceite de canela comparado con el aceite de orégano, sin embargo, las mezclas de ambos aceites no muestran efecto sinérgico presentando aún menor efecto antibacteriano que el aceite de canela. 42 Tabla 5. Prueba de distribución normal Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statisti Grupos de trabajo Statistic df Sig. c df Sig. Aceite de canela - 50% 0,112 15 0,200* 0,963 15 0,747 Aceite de canela - 75% 0,194 15 0,135 0,887 15 0,601 * Diámetro del halo de Aceite de canela - 100% 0,168 15 0,200 0,949 15 0,501 inhibición (mm) Aceite de orégano - 50% 0,125 15 0,200* 0,970 15 0,863 Aceite de orégano - 75% 0,183 15 0,187 0,921 15 0,201 Aceite de orégano - 100% 0,118 15 ,200* 0,969 15 0,846 Aceite de canela + 0,151 15 ,200* 0,966 15 0,803 orégano - 50% Aceite de canela + 0,120 15 ,200* 0,934 15 0,317 orégano - 75% Aceite de canela + 0,217 15 0,055 0,834 15 0,091 orégano - 100% Control negativo 0,198 15 0,116 0,897 15 0,086 *. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction Fuente: SPSS ver. 26 En la tabla 5 se muestra el análisis de la distribución normal, realizado mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk, con un nivel de confianza del 95,00%, se observa que el nivel de significancia calculado en tabla supera el nivel de significancia de 0,05 establecido por el estudio para todos los grupos de trabajo, por lo tanto, se confirma que todos los grupos analizados presentan distribución normal. 43 Tabla 6. Prueba de homogeneidad de varianzas (Levene) Estadístico p- de Levene df1 df2 valor Se basa en la media 1,771 9 140 0,079 Diámetro del Se basa en la mediana 1,635 9 140 0,111 halo de Se basa en la mediana y con gl 1,635 9 95,939 0,116 inhibición ajustado Se basa en la media recortada 1,769 9 140 0,079 Fuente: SPSS ver. 26 En la interpretación de la tabla 6, se muestra la prueba de Levene o de homogeneidad de varianzas aplicada donde luego del análisis se observa que un p-valor en superior al nivel alfa de significancia de 0,05; por lo tanto, se deduce que existe varianzas homogéneas en todos los grupos analizados con un nivel de confianza del 95,00%. 44 Anexo D. Certificado de análisis de la cepa ATCC 45 46 Anexo E. Identificación taxonómica de Origanum vulgare L. (ORÉGANO) 47 Anexo F. Certificado de calidad del aceite esencial de Cinnamomun Zeylanicum Blume (CANELA) 48 Anexo G. Protocolo de conservación de los aceites esenciales 49 Anexo H. Evidencias fotográficas del trabajo de campo Figura 2. Recolección de Origanum vulgare L. (Orégano) 50 Figura 3. Selección y separación de las hojas 51 Figura 4. Instalación del equipo de destilación por arrastre con vapor Figura 5. Obtención del aceite esencial de Origanum vulgare L. (Orégano) 52 Figura 6. Decantación del aceite esencial Figura 7. Preparación de las concentraciones de los aceites esenciales 53 Figura 8. Activación de la cepa Figura 9. Elaboración de pozos en agar 54 Figura 10. Aplicación de los aceites en el medio de cultivo Figura: 11. Medición del halo de inhibición (CANELA Y ORÉGANO) 55