FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA PROTECCIÓN ANTIFÚNGICA IN SITU DEL ACEITE ESENCIAL DE Cymbopogon citratus FRENTE A HONGOS AMBIENTALES EN LA CONSERVACIÓN POST-COSECHA DE Fragaria vesca var. Aromas TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES: Bach. CAMUS RAMOS, ELVA MARI Bach. DE LA CRUZ ORTIZ, NOEMÍ ELIZABETH ASESOR: MSc. CÓRDOVA SERRANO, GERSON LIMA-PERÚ 2021 i AGRADECIMIENTO A nuestros maestros y asesor Msc. Gerson Córdova Serrano por su paciencia y por el aporte de sus conocimientos en nuestras asesorías durante todo este proyecto de investigación y también para los que de una u otra forma nos han apoyado como la Ing. Zulema Torres muchas gracias a todos. Bach. Camus Ramos Elva Mari Bach. De La Cruz Ortiz Noemí Elizabeth ii DEDICATORIA Ante todo, agradecer a Dios por brindarnos un día más de vida y darnos la fuerza necesaria para culminar este proyecto de investigación. A nuestra familia por brindarnos su apoyo incondicional en cada momento, por aquellos que también ya no están entre nosotros que sabemos que desde el cielo nos están cuidando. Bach. Camus Ramos Elva Mari Bach. De La Cruz Ortiz Noemí Elizabeth iii ÍNDICE GENERAL AGRADECIMIENTO ii DEDICATORIA iii ÍNDICE GENERAL iv ÍNDICE DE TABLAS v ÍNDICE DE FIGURAS vi ÍNDICE DE ANEXOS vii RESUMEN viii ABSTRACT ix I. INTRODUCCIÒN 1 II. MATERIALES Y MÈTODOS 6 2.1. Enfoque y diseño de investigación 6 2.2. Población, muestra y muestreo 6 2.3. Variables de investigación 6 2.4. Técnica e instrumento de recolección de datos 7 2.5. Proceso de recolección de datos 7 2.6. Métodos de análisis estadístico 12 2.7. Aspectos éticos 12 III. RESULTADOS 13 IV. DISCUSIÓN 27 4.1. Discusión 27 4.2. Conclusiones 30 4.3. Recomendaciones 31 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32 ANEXOS 38 iv ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Protección antifúngica in situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a hongos ambientales en la conservación post-cosecha de Fragaria vesca. 10 Tabla 2. Análisis de varianza ANOVA de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 36, 48 y 60 horas. 16 Tabla 3. Análisis de Kruskal-Wallis de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 36 horas. 18 Tabla 4. Análisis de Kruskal-Wallis de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 48 horas. 20 Tabla 5. Análisis de Kruskal-Wallis de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 60 horas. 22 Tabla 6. Pruebas Post-Hoc de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 36 horas. 24 Tabla 7. Pruebas Post-Hoc de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 48 horas. 25 Tabla 8. Pruebas Post-Hoc de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 60 horas. 26 v ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Porcentaje de inhibición de la proliferación de hongos ambientales en Fragaria vesca según horas y grupos de exposición del aceite esencial de Cymbopogon cItratus. 13 Figura 2. Porcentaje de inhibición de la proliferación de hongos ambientales en Fragaria vesca por grupos experimentales del aceite esencial de Cymbopogon cItratus. 14 Figura 3. Porcentaje de inhibición de la proliferación de hongos ambientales en fragaria vesca por horas de exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus. 15 vi ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO A. Operacionalización de variables 39 ANEXO B. Instrumentos de recolección de datos 40 ANEXO C. Porcentaje de inhibición por grupo de investigación 41 ANEXO D. Estadística descriptiva 42 ANEXO E. Homocedasticidad 43 ANEXO F. Comparaciones multiples Post-Hoc: 36, 48 y 60 horas 44 vii RESUMEN Objetivo: Determinar la protección antifúngica in situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a hongos ambientales en la conservación postcosecha de Fragaria vesca var. Aromas. Materiales y método: Se realizó una investigación de enfoque cuantitativo, diseño metodológico experimental, explicativa y de corte longitudinal. Se realizó un muestreo por conveniencia y no probabilístico. El aceite esencial se extrajo a partir de la hoja fresca de la planta de Cymbopogon citratus por el método de arrastre de vapor. La selección de los hongos ambientales, en especial de Botrytis sp. se desarrolló por el método de observación directa al microscopio de una pequeña muestra de las frutas infestadas con hongos. Resultados: La protección antifúngica del aceite esencial de Cymbopogon citratus en concentración de 125 ppm es la que potencialmente tiene el mejor perfil a comparación de los demás grupos. Las 12 y 24 horas, en todos los grupos de experimentación se presentó un mismo porcentaje del 100% de inhibición, lo que significa que las Fragaria vesca se mantuvieron inalteradas durante 24 horas, comenzando su deterioro progresivo a las 36 horas a diferenciarse de los grupos de estudio. Conclusiones: Los porcentajes de inhibición fueron del 100 % del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre la especie Botrytis sp. en Fragaria vesca, a la concentración de 125 ppm hasta las 60 horas de exposición, observándose a las 72 horas una disminución del 50%. Palabras clave: Aceite esencial, antifúngica, cuantitativo, Cymbopogon citratus, experimental. viii ABSTRACT Objective: To determine the in situ antifungal protection of Cymbopogon citratus essential oil against environmental fungi in the post-harvest preservation of Fragaria vesca var. Aromas. Materials and methods: A quantitative approach, experimental methodological design, explanatory and longitudinal research was carried out. A non-probabilistic convenience sampling was carried out. The essential oil was extracted from the fresh leaf of the Cymbopogon citratus plant by the vapour entrainment method. The selection of environmental fungi, especially Botrytis sp. was developed by the method of direct microscopic observation of a small sample of the fungus-infested fruits. Results: The antifungal protection of the essential oil of Cymbopogon citratus at a concentration of 125 ppm is potentially the one with the best profile compared to the other groups. At 12 and 24 hours, all experimental groups showed the same percentage of 100% inhibition, which means that the Fragaria vesca remained unaltered for 24 hours, with progressive deterioration beginning at 36 hours and differentiating from the study groups. Conclusions: The inhibition percentages were 100 % of the essential oil of Cymbopogon citratus on the species Botrytis sp. on Fragaria vesca, at a concentration of 125 ppm up to 60 hours of exposure, with a decrease of 50 % at 72 hours. Key words: Essential oil, antifungal, quantitative, Cymbopogon citratus, experimental ix INTRODUCCIÓN Para tener una vida saludable es necesario tener una alimentación balanceada. Los alimentos saludables son esenciales para el ser humano para sentirse bien, mantenerse sano, con mucha energía y así evitar diversas enfermedades. Dentro de estos se encuentran el consumo de las frutas debido a su contenido de antioxidantes que estos a su vez son beneficiosos porque contribuyen a hacer más lento el envejecimiento y evita las enfermedades cardiovasculares. Se recomienda consumirlas antes de las comidas por su contenido de fibras que ayudan a la digestión1. Según la Organización mundial de la salud (OMS), lo que nos alimentamos y bebemos puede afectar la capacidad de nuestro organismo, malos hábitos de alimentación pueden desencadenar problemas de salud en el futuro, como obesidad, enfermedades cardíacas, diabetes y diferentes tipos de cáncer 2. Dentro de las opciones de consumo de frutas a nivel mundial, debido a su sabor, aroma y propiedades nutricionales, encontramos a la Fragaria vesca (fresa), que pertenece al Reino: Plantae, la familia: Rosaceae, clase: Magnoliopsida. Esta fruta es roja oscura, más firme y es adaptable tanto para el mercado fresco como para procesado. Además de tener resistencia a condiciones adversas como la falta de agua, bajas y altas temperaturas 1,2. Entre sus propiedades etnofarmacológicas se ha demostrado que ayuda a disminuir el nivel de colesterol malo (LDL) en sangre, gracias a la gran cantidad de ácido ascórbico, lecitina y pectina que contiene dicha fruta, además se le atribuye otras propiedades como, estimulante estomacal, depurativo, diurético, contra la diabetes, obesidad y gota 3. A nivel nutricional los frutos de Fragaria vesca son abundantes en antioxidantes como ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas. También es una fuente de vitaminas del grupo B, como la vitamina B6, la niacina, la riboflavina, el ácido pantoténico o el ácido fólico4,5. El cultivo y la comercialización de Fragaria vesca, se han incrementado a nivel mundial ya que se consume en todas partes del mundo, debido a su sabor, aroma y propiedades nutricionales. Según el mercado mundial de fresa; del 2007 al 2016 se puede verificar que es un fruto con mayor exportación e importación y consumo en diferentes países como: China, EEUU y Asia 6. 1 En el Perú, las más grandes plantaciones de fresa están ubicadas en las provincias del norte de la Región Lima; tales como: Barranca, Huaral, Huaura, Huacho. Siendo la etapa de cosecha en los meses octubre, noviembre y diciembre. Uno de los princípiales problemas que limitan la producción agro- industrial y la comercialización a gran escala de la Fragaria vesca es el ataque por hongos ambientales; entre ellos por hongos del género Botrytis sp, los cuales disminuyen la vida útil postcosecha de la fruta 7,8. Esto ocasiona grandes pérdidas económicas, afectando la productividad tanto en términos de cantidad como en calidad del producto cosechado 9. Durante el cultivo, la cosecha y el transporte de Fragaria vesca, esta es infectada por una variedad de hongos ambientales (entre ellos hongos del género Botrytis sp.), permaneciendo en estado latente hasta alcanzar las condiciones atmosféricas adecuadas (climas húmedos y frescos); y durante la maduración de dicha fruta se vuelven visibles (produciendo abundantes conidios y formando esporas) coincidiendo con el periodo de postcosecha (transporte y almacenamiento) 10,11. Los hongos del género Botrytis sp son especies cosmopolitas que atacan a la fruta Fragaria vesca, que se manifiestan mediante la enfermedad conocida como la podredumbre gris o moho gris; la cual es principalmente causada por la especie Botrytis cinérea. Finalmente, cuando las condiciones son las adecuadas, crece rápidamente destruyendo totalmente a Fragaria vesca 12. Tomando en consideración lo previamente descrito, es de importancia garantizar la conservación postcosecha de la fresa para lograr que su producción y comercialización no se vea severamente comprometida, de esta manera, convertir a este producto en un rubro importante en la producción agro-industrial peruana. En la búsqueda de nuevos métodos de conservación postcosecha, esta se ha inclinado hacia el uso de productos naturales, como por ejemplo los aceites esenciales de orégano (Origanum vulgare L.), tomillo (Thymus vulgaris L.), romero (Rosmarinus officinalis L.), cilantro (Coriandrum sativum L.), cebolla (Allium cepa L.), ajo (Allium sativum L.) y canela (Cinnamomum zeylanicum). Los estudios antes mencionados han demostrado que el empleo de 2 aceites esenciales es muy útil en la conservación de productos agrícolas como la Fragaria vesca 13. Con el afán de evitar la proliferación de hongos ambientales (como el hongo Botrytis cinérea), se toma en consideración que el aceite esencial de Cymbopogon citratus (hierba luisa) pueda ser de utilidad la durante conservación postcosecha de la fruta Fragaria vesca variedad aromas14; puesto que posee diversas propiedades terapéuticas como el antimicrobiano, además de ser considerado uno de los aceites esenciales con un elevado efecto antioxidante15. Cymbopogon citratus es una planta herbácea que pertenece a Reino: Plantae, Superfilo: Cormobionta, División: Magnoliophyta, Clase: Liliatae (Liliopsida), Subclase: Commelinidae, Orden: Cyperales, Familia: Poaceae Tribu: Andropogoneae Dumort, Género: Cymbopogon, Especie: Citratus, de aquí el nombre científico de Cymbopogon citratus, se le conoce también como limoncillo, sus hojas son de color verde oscuro tiene unos bordes ásperos llenas de cerdas parecidos al filo de un serrucho que al manipularse puede causar alguna lesión14. Las hojas poseen un fuerte olor a limón ya que en el lado central del mesófilo y entre los haces vasculares se encuentran las células donde se almacenan el aceite esencial el cual está presente el citral. Tradicionalmente ha sido utilizado para tratar la fiebre y las enfermedades infecciosas, pues es un poderoso antiséptico, antimicrobiano, antifúngico y propiedades terapéuticas. El té hecho de sus hojas se usa popularmente como antiespasmódico, analgésico, antipirético, diurético, antinflamatorio y sedante 16. El aceite esencial de Cymbopogon citratus, se caracteriza por su fuerte olor a limón es un producto obtenido de las hojas y el tallo por medio de una destilación por arrastre de vapor. Se trata de un aceite esencial natural sin aditivos químicos14. Este aceite posee diversas propiedades terapéuticas, y posee propiedades antisépticas por el coeficiente fenol, con el método de arrastre de vapor en la caracterización del aceite de hierba luisa se puede ver que se encontraron tres componentes principales según el análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, en el cuales son el beta mirceno con un 56.54%, el cual tiene la propiedad de ser antinflamatorio, beta citral en un 3 11.99% y alfa citral en un 17.40% que revisando las investigaciones podemos decir que ambos son antibacterianos17. Investigaciones previas han demostrado el efecto antifúngico de los aceites esenciales por ejemplo según, Espinoza (2016) 18, determinó el efecto comparativo del aceite esencial y el extracto acuoso de hojas de Shinus molle, sobre el crecimiento del hongo Botrytis cinerea, y el extracto acuoso al 10%; a partir de los cuales se aplicaron tratamientos al: 0%, 3% , 7% y 15%, en medio agar papa dextrosa (APD) con cinco unidades muéstrales, donde el aceite esencial demostró tener mayor efecto antifúngico en comparación al extracto acuoso. Asimismo, Gamarra (2017) 19 permitió determinar que el tratamiento de cobertura comestible de gelatina-almidón con aceite esencial de clavo de olor al 0.2% presentó menor pérdida de peso, sólidos solubles y recuento de mohos y levaduras; mayor firmeza y menor variación. Además, Robello (2018) 20, realizó un estudio de la extracción del aceite esencial de Thymus vulgaris L. como componente biofungicida capaz de disminuir la germinación de Botrytis cinérea. Concluyendo que el biofungicida fue capaz de controlar a Botrytis cinérea hasta el tercer día de la evaluación. Para lo cual, Camacho (2017) 21, evaluó la capacidad antifúngica del extracto de champa sobre Botrytis cinérea y Rhizopus stolonifer en Rubus glaucus donde evaluó su acción antifúngica y demostró tener mayor capacidad inhibitoria en R. stolonifer que en B. cinerea. Donde Meza y Vargas (2013) 22, realizaron la evaluación de la actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de Cymbopogon citratus contra Propionibacterium acnes, utilizando concentraciones desde 0.02% a 5% de aceite se determinó que existe inhibición desde la concentración al 0.05% hasta la concentración del 5%. Por tanto, la concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial es 0.05 µg/mL. Por tal motivo, fue la concentración elegida para la posterior formulación y elaboración de la loción. De manera similar, Maravì (2012) 23, estudia el efecto antibacteriano y antifúngico in vitro de tres aceites esenciales mediante el método de difusión en agar con disco demostrando un efecto en el siguiente orden: Cymbopogon citratus, Origanum vulgare y Mentha piperita, siendo asi una buena alternativa para evitar el uso de productos sintéticos en el control de los tres patógenos ensayados (Streptococcus mutans ATCC 25175, Lactobacillus acidophilus ATCC 10746 y Candida albicans ATCC 90028) dando como 4 resultado que el aceite esencial de Cymbopogon citratus al 90 % posee mayor actividad antifúngica que antibacteriana, ya que formó un halo inhibitorio de 76.15 mm sobre Candida albicans ATCC 90028. En cuanto a la justificación del estudio, podemos decir que el uso de los aceites esenciales en la inhibición de la proliferación de los hongos ambientales (como los del género Botrytis sp), a nivel teórico, el estudio brindará evidencia y mayor información sobre los principios fitoquímicos de origen natural con respecto a los aceites esenciales de la hierba luisa (Cymbopogon citratus) y su relación en la capacidad de inhibición de Botrytis cinérea en la fresa. Además, a nivel práctico, surge la necesidad de evitar la propagación de estos hongos para prolongar la vida postcosecha de la fresa. Ya que son situaciones que impiden el desarrollo o progreso de las personas que se dedican a este cultivo evitando muchas pérdidas económicas. Tomando en consideración que los aceites esenciales son muy útiles en la conservación postcosecha y que el Cymbopogon citratus, posee un aceite esencial el cual ha sido demostrado que tiene propiedades antimicrobianas y antibacterianas; el objetivo de este estudio es determinar la protección antifúngica in situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a hongos ambientales en la conservación postcosecha de Fragaria vesca var. Aromas. Finalmente, la hipótesis planteada es que al menos una concentración en partes por millón (ppm) del aceite esencial de Cymbopogon citratus tendrá la capacidad de disminuir la incidencia de los hongos ambientales en la conservación postcosecha de Fragaria vesca. 5 II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Enfoque y diseño de la investigación El presente estudió es de enfoque cuantitativo, en cuanto al diseño metodológico es una investigación experimental, explicativa y de corte longitudinal. Es experimental porque se aborda a la variable independiente interviniendo en la cantidad que se hará incidir sobre la variable dependiente en un medio controlado no natural. Es longitudinal por que la recolección de datos se dará en varios puntos temporales del tiempo. 2.2. Población, muestra y muestreo En el presente estudio se trabajó con la población de la especie Fragaria vesca de orden Rosales; familia Rosaseae y géneros Fragaria; esta especie proviene de la provincia de Huaral del departamento de Lima. Las muestras son de tipo no probabilístico, las cuales están conformadas por los especímenes recolectados en el mercado mayorista de frutas. Con respecto a los criterios de inclusión, se escogieron las muestras de la fresa variedad aromas, que tengan buen sabor, peso aproximadamente (15 – 28 gramos por fruta), fresas sin lesiones, fresas maduras y de cosecha reciente. Con respecto a los criterios de exclusión, no se admiten las muestras de fresas en mal estado, fresas con un peso menor que lo aproximado y fresas que no estén maduras. 2.3. Variables de investigación El presente estudio presenta dos variables. La primera variable es el aceite esencial de Cymbopogon citratus. Según su naturaleza es de tipo cuantitativa y según su escala de medición es de razón. Definición conceptual: Fracción liquida volátil obtenida por destilación de arrastre de vapor de agua, que contiene las sustancias responsables del aroma de la especie Cymbopogon citratus 14. Definición operacional: concentración porcentual de la fracción volátil de Cymbopogon citratus 6 La segunda variable es la incidencia de Botrytis sp. en la conservación postcosecha de Fragaria vesca. Según su naturaleza es una variable compleja que presenta tres dimensiones, o sub-variables, cada una con su propia naturaleza y escala de medición. Definición conceptual: Los frutos de Fragaria vesca, post-cosechas son contaminados por hongo ambientales como Botrytis sp a causa de la humedad, ya que es uno de los medios que permite la proliferación de dicho hongo24. Definición operacional: Cantidad de frutos contaminados con Botrytis. Sp. ante conservación postcosecha de Fragaria vesca. 2.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos Las técnicas utilizadas durante la recolección de datos fueron de tipo analítico empleados frecuentemente en la investigación fitoquímica y de tipo microbiológico. Por tal motivo se utiliza instrumentos de recolección de datos diseñados para examinar las variables y sub-variables relacionadas a un tamizaje fitoquímico básico y la evaluación del efecto antifúngico de productos naturales. 2.5. Proceso de recolección de datos a) Recolección y selección de muestra botánica Se seleccionaron las fresas de la variedad aromas, con buen aspecto en color, tamaño con un peso aprox. (15 – 28 gramos por fruta), estuvieron maduras y sin lesiones, las cuales fueron adquiridas en Huaral en distrito de Huaral del departamento de Lima. Se compraron ocho kilos de fresa madura aproximadamente para la elaboración del proyecto, en la cual se utiliza por cada nivel de tratamiento veinte unidades de dicha fruta completamente sanas sin lesiones. b) Preparación de la muestra botánica Se utilizaron frutas maduras que se lavaron con agua corriente y se enjuagaran con agua destilada tres veces, posteriormente se desinfectara con una solución de hipoclorito al 1% el cual se enjuaga con agua destilada estéril dejándolo secar a temperatura ambiente (25 ± 3°C). 7 En cada tratamiento se empleará 20 frutos como unidad experimental y tres repeticiones de cada una, aplicándoles el tratamiento correspondiente. c) Obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus El aceite esencial se extrajo a partir de la hoja fresca de la planta de Cymbopogon citratus por el método de arrastre de vapor, se cortó en pequeños trozos, luego se pesó seis kilos y se colocó en la máquina de acero industrial marca INOXI MEXICO a una temperatura de 25ºC a 30ºC con la finalidad de evitar pérdidas de aceite esencial por volatilización con una duración de 3 a 4 horas, el aceite esencial con el agua fueron recibidos en un vaso florentino, donde se logra la separación física por el principio de diferencia de densidades, el aceite decantado fue envasado en un frasco de vidrio de color ámbar. d) Preparación de los hongos ambientales. Se dejó a temperatura ambiente las frutas por cinco días hasta cuando empieza la pudrición causada por diversos hongos. Se tomaron muestras pequeñas de hongos con ayuda de un sacabocados de 4 milímetros (mm) de diámetro y se colocó en el centro de una caja petri con agar papa dextrosa agar (PDA). Se selló las cajas petri con cinta, se etiquetó y se protegió en fundas plásticas para evitar cualquier contaminación con otros hongos. Se mantuvo en crecimiento en un lugar oscuro a temperatura ambiente. f) Preparación de suspensión de esporas de hongos ambientales Para preparar la solución de esporas, se preparó una suspensión del micelio del hongo agregando agua destilada esterilizada en una caja de petri que contenía micelio sembrado, luego se raspa la superficie de la caja y se filtró la solución a través de una capa de gasa esterilizada; la suspensión filtrada se diluyó con agua destilada esterilizada hasta obtener la concentración de 1x 105 esporas/mL. Posteriormente se preparó la suspensión de esporas de 1.x105 esporas/mL; La solución se colocó en un atomizador y se mantuvo en agitación hasta la inoculación de los frutos. 8 g) Conservación postcosecha de Fragaria vesca - Características organolépticas de la fruta El análisis sensorial de las frutas investigadas se realizó a través de los sentidos de la vista, olfato, tacto y gusto 26, 27. - Determinación del pH La medición del pH de los frutos se determinará mediante el uso de cintas indicadoras 28. h) Protección antifúngica in-situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus por el método de inmersión El objetivo principal del aceite esencial, con su actividad microbiana, es impedir el crecimiento y la proliferación de los hongos causantes de la pudrición de la fruta en estudio: fresa variedad aromas. El método de inmersión se estableció como el método para conservar a las fresas en buen estado ya que con este método existe un recubrimiento total de la fruta y no existe pérdida de la solución26. Se consideró tres variables: temperatura, concentración y tiempo, las dos primeras con dos niveles cada una. - Preparación de los tratamientos Para ello se preparó una solución madre de 100000 ppm disolviendo 50 mg de aceite esencial en 500 mL de Tween 20. A partir de esta dilución se prepararon diluciones seriadas al décimo hasta obtener una dilución de trabajo de 10000 ppm. Con la solución de trabajo se prepararon 3 soluciones “tratamiento” de aceite esencial de Cymbopogon citratus de 125, 75 y 25 ppm en un volumen final de 500 mL. - Aplicación de los tratamientos. Se empleó una cantidad de 120 frutos de Fragaria vesca que fueron distribuidos en los siguientes grupos (Tabla 1): Tabla 01. Protección antifúngica in situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a hongos ambientales en la conservación postcosecha de Fragaria vesca. 9 Fuente: elaboración propia Se colocó veinte frutos de Fragaria vesca por cada grupo de experimentación. A cada fruto, cerca del pedúnculo, se le hizo una lesión ID GB GCN GCP GE1 GE2 GE3 Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo GrupoBlanco Control Control experimental experimental experimentalNegativo Positivo 1 2 3 Tratamiento Agua Fungicida Aceite Aceite Aceitedestilada Tween-20 Benlate esencial esencial esencial Número de frutos 20 20 20 20 20 20 Dosis 50ml 0.2ml 0.125mg 125 ppm 75 ppm 25 ppm Vía de administración --- Aspersión Aspersión Aspersión Aspersión Aspersión de 2 mm de profundidad y 2 mm de ancho con una hoja de bisturí estéril. Luego cada fruto era sumergido en las soluciones de tratamiento durante 5 segundos según, corresponda a su grupo de investigación, seguido de un periodo de secado de 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, los frutos en todos los grupos de experimentación (con excepción del grupo GB, Tabla 01) fueron asperjados con la solución de esporas de Botrytis sp. 1.x105 esporas*mL-1. - Almacenamiento y observación Durante el ensayo, los frutos tratados fueron almacenados en las mismas condiciones de temperatura y humedad. Los frutos sumergidos en la solución de aceite esencial, fueron colocados dentro contenedores de plástico previamente dispuestos para el almacenamiento. En cada contenedor se colocó los 20 frutos del mismo tratamiento a una distancia de 2 a 3 cm. Se observó cada 12 horas a temperatura ambiente (25°C), registrando la fluctuación de la temperatura mediante mediciones continuas con un termo hidrómetro digital, además los frutos se cambió de posición cuidadosamente en cada observación para igualar las condiciones en todos los tratamientos. En diez frutos de cada grupo de experimentación se registró el diámetro de las lesiones, en cada periodo de observación (cada 12 horas) se verificó la expansión de la infección en comparación con la superficie 10 total de cada fruto. Así mismo, en los 10 frutos restantes se registró el cambio en las características organolépticas y pH de las fresas. Se utilizó una escala de categorías según el porcentaje de infección en la superficie del fruto correspondiente hasta el siguiente indicador porcentual: 0= 0%, 12= 0%, 24= 4%, 36= 6%, 48= 15%, 60=84% y 72= 100% de infección por fruto. Esta escala diagramática se utilizó para seguir el progreso de la infección de los frutos a las 48, 60 y 72 horas; Adicionalmente, se determinó el porcentaje de control de cada tratamiento sobre los hongos patógenos evaluados, en función del porcentaje de infección presentado por el testigo negativo tal como se evidencia en la siguiente ecuación. % in vivo = 1 - % de infección de frutos tratados – 72h * 100 % de infección testigo negativo -72 h 2.6. Métodos de análisis estadístico La realización del análisis estadístico de las variables involucradas en esta investigación se aplicó las pruebas estadísticas descriptivas como frecuencias absolutas, frecuencias relativas y medidas de tendencia central. Además, se realizó pruebas de t-Student y ANOVA para observar diferencias entre los tratamientos aplicados para evaluar el efecto del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre la incidencia de hongos ambientales en la conservación de Fragaria vesca. 2.7. Aspectos éticos Se realizó la investigación teniendo en cuenta los aspectos bioéticos de autonomía, no maleficencia, beneficencia y justicia durante la ejecución del proyecto de investigación. Cabe señalar, que en especies utilizadas en experimentación implica la educación del investigador para el logro de resultados fiables de experimentación que justifiquen su implementación en 11 la ciencia y enseñanza. Asimismo, se mantuvo un ambiente controlado para cumplir con los parámetros sanitarios y para asegurar la uniformidad en relación a las variables experimentales. Todo ello siempre en la búsqueda constante del conocimiento. 12 III. RESULTADOS 3.1. Características organolépticas de Fragaria vesca durante la evaluación de la protección antifúngica frente hongos ambientales. Tabla 2. Color de Fragaria vesca durante la evaluación de la protección antifúngica frente hongos ambientales Horas de Iniciado el Tratamiento A 28°C 0 12 24 36 48 60 72 CONTROL BLANCO Rojo Brillante Rojo Brillante Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Oscuro (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) Oscuro(20/20) (20/20) CONTROL NEGATIVO/ TWEEN Rojo Brillante Rojo Brillante Rojo Rojo Rojo Rojo (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) Oscuro Rojo Oscuro 20 (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Rojo Brillante Rojo Brillante Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Oscuro 25 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) Oscuro Color (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Rojo Brillante Rojo Brillante Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Oscuro 75 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) Oscuro(20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Rojo Brillante Rojo Brillante Rojo Rojo Rojo RojoOscuro Rojo Oscuro125 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) Rojo Brillante Rojo Brillante Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Oscuro (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) Oscuro(20/20) (20/20) CONTROL POSITIVO Fuente: Elaboración propia En la Tabla 2 se puede observar que la Fragaria vesca de todos los grupos de investigación tuvieron un color un rojo brillante (fruta fresca) hasta las 12 horas y posteriormente mantuvieron el color hasta las 48 horas hasta un color oscuro signo de descomposición a las 60 horas de evaluación. 13 Tabla 3. Textura de Fragaria vesca durante el tratamiento de protección antifúngica frente hongos ambientales Horas de Iniciado el Tratamiento A 28°C 0 12 24 36 48 60 72 CONTROL Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa Blanda Blanda Blanda BLANCO (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) CONTROL NEGATIVO/ TWEEN Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa Blanda Blanda 20 (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa Blanda Blanda Blanda Textura 25 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa Blanda Blanda Blanda 75 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa Blanda Blanda Blanda 125 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) CONTROL Carnosa Carnosa Carnosa Carnosa BLANDA BLANDA BLANDA POSITIVO (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) Fuente: Elaboración propia En la Tabla 3 se puede observar que la Fragaria vesca de todos los grupos de investigación tuvieron una textura un carnosa (fruta fresca) hasta las 12 horas y posteriormente mantuvieron la textura hasta las 36 horas hasta una textura blanda signo de descomposición a partir de las 48 horas de evaluación. 14 Tabla 4. Olor de Fragaria vesca durante el tratamiento de protección antifúngica frente hongos ambientales Fecha: Horas de Iniciado el Tratamiento A 28°C 0 12 24 36 48 60 72 CONTROL Caracteristico Caracteristico Caracteristico Caracteristico Fermentado Fermentado Fermentado BLANCO (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) CONTROL NEGATIVO/ Caracteristico Caracteristico Caracteristico Caracteristico Fermentado Fermentado Fermentado TWEEN 20 (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Caracteristico Caracteristico Caracteristico Caracteristico Fermentado FERMENTA FERMENTAOlor 25 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) DO (20/20) DO (20/20) ACEITE ESENCIAL Caracteristico Caracteristico Caracteristico Caracteristico Fermentado Fermentado Fermentado 75 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) ACEITE ESENCIAL Caracteristico Caracteristico Caracteristico Caracteristico Fermentado Fermentado Fermentado 125 ppm (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) CONTROL Caracteristico Caracteristico Caracteristico Caracteristico Fermentado Fermentado Fermentado POSITIVO (20/20) (20/20) (10/20) (10/20) (15/20) (20/20) (20/20) Fuente: Elaboración propia En la Tabla 4 se puede observar que la Fragaria vesca de todos los grupos de investigación tuvieron un olor característico a fruta fresca hasta las 12 horas y posteriormente mantuvieron su olor hasta las 36 horas hasta un olor fermentado signo de descomposición a partir de las 48 horas de evaluación. 15 Tabla 5. Sabor de Fragaria vesca durante el tratamiento de protección antifúngica frente hongos ambientales 0 12 24 36 48 60 72 CONTROL Dulce Dulce BLANCO Agradable Agradable Agridulce Agridulce (1/20) (1/20) Ácido (1/20) Ácido (1/20) N/S(1/20) (1/20) CONTROL Dulce Dulce NEGATIVO/ Agradable Agradable Agridulce Agridulce Ácido (1/20) Ácido (1/20) N/S TWEEN 20 (1/20) (1/20) (1/20) (1/20) ACEITE Dulce Dulce ESENCIAL Agradable Agradable Agridulce Agridulce ÁCIDO 25 ppm (1/20) (1/20) (1/20) (1/20) Ácido (1/20) (1/20) N/S Sabor ACEITE Dulce Dulce ESENCIAL Agradable Agradable Agridulce Agridulce(1/20) (1/20) Ácido (1/20) Ácido (1/20) N/S75 ppm (1/20) (1/20) ACEITE Dulce Dulce ESENCIAL Agradable Agradable Agridulce Agridulce(1/20) (1/20) Ácido (1/20) Ácido (1/20) N/S125 ppm (1/20) (1/20) Dulce Dulce Agradable Agradable Agridulce Agridulce CONTROL (1/20) (1/20) (1/20) (1/20) Ácido (1/20) Ácido (1/20) N/S POSITIVO Fuente: Elaboración propia En la Tabla 5 se puede observar que la Fragaria vesca de todos los grupos de investigación tuvieron un sabor dulce agradable de fruta fresca hasta las 12 horas y posteriormente tuvieron un sabor más agridulce las 36 horas hasta un sabor acido signo de descomposición a partir de las 48 horas de evaluación. 16 Tabla 6. Acidez de Fragaria vesca durante el tratamiento de protección antifúngica frente hongos ambientales Horas de Iniciado el Tratamiento A 28°C 0 12 24 36 48 60 72 CONTROL BLANCO 5 5 9 9 9 9 9 CONTROL NEGATIVO/ 5 5 9 9 9 9 9 TWEEN 20 ACEITE pH ESENCIAL 5 5 9 9 9 9 9 25 ppm ACEITE ESENCIAL 5 5 9 9 9 9 9 75 ppm ACEITE ESENCIAL 5 5 9 9 9 9 9 125 ppm CONTROL POSITIVO 5 5 9 9 9 9 9 Fuente: Elaboración propia En la Tabla 6 se puede observar que la Fragaria vesca de todos los grupos de investigación tuvieron un pH de 5 hasta las 12 horas y posteriormente tuvieron un pH mas alcalino a partir de las 36 horas de evaluación. En su conjunto las características organolépticas durante la evaluación de la protección antifúngica de la Fragaria vesca frente a hongos ambientales mediante el uso de aceite esencial de Cymbopogon citratus han seguido la misma evolución a lo largo de las horas sin alguna diferencia entre los grupos de investigación, evidenciando que la presencia de aceite esencial (incluso de un antifúngico comercial) no influye en el proceso natural de descomposición de la fruta aunque prevenga la proliferación de hongos ambientales por lo que pueden existir otros factores, como la temperatura, que pueden extender la natural descomposición de la fruta en conjunto. 17 3.2. Protección antifúngica in-situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus por el método de inmersión. A continuación los resultados obtenidos: Grupo Control Antifungico Tween 25 ppm 75 ppm 125 ppm 120 100 80 60 40 20 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 Horas de exposicion Figura 1. Porcentaje de inhibición de la proliferación de hongos ambientales en Fragaria vesca según horas y grupos de exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus. Fuente: Elaboración propia. En la Figura 1 se puede observar en la evolución de la protección antifúngica del aceite esencial de Cymbopogon citratus en concentración de 125 partes por millón (ppm) es la que potencialmente tiene el mejor perfil a comparación de los demás grupos de estudio. También se observa que el grupo control negativo (tween 0.2 mL) presenta un aparente efecto inhibidor de la proliferación de hongos ambientales, el cual es muy similar al obtenido con la concentración de 75 ppm de aceite esencial, lo que sugiere una actividad antifúngica sinérgica por parte del tween. 18 Porcentaje de inhibición 120 100 100 100 100 100 100 100 86.505 80 74.8 75.41 12 Horas 62.44 62.575 60.24 24 Horas 60 50.85 50.855 36 Horas 47.265 48 Horas 40 60 Horas 31.775 72 Horas 25.185 25.265 20 12.64 12.665 0 0 0 0 0 0 0 0 Control Antifungico Tween 25 75 125 Grupos experimentales Figura 2. Porcentaje de inhibición de la proliferación de hongos ambientales en Fragaria vesca por grupos experimentales del aceite esencial de Cymbopogon citratus Fuente: Elaboración propia. En la Figura 2, agrupando los porcentajes de inhibición obtenidos durante las horas de exposición con el aceite esencial de hierba Cymbopogon citratus, se puede señalar que la concentración de 125 ppm de aceite esencial ha logrado mantener un 100% de inhibición de la proliferación de hongos ambientales hasta las 60 horas de exposición, observándose recién a las 72 horas una caída de más del 50%. Se va perfilando la similitud en la dinámica de inhibición de proliferación de hongos ambientales tanto con la concentración 75 ppm de aceite esencial en comparación de control negativo (tween) en el porcentaje empleado y observándose el grupo blanco, solamente después de las 24 horas de mantenerse la muestra de fresa en un 100% de inhibición, y comienza a decaer muy ligeramente llegando a 12.64% a las 48 horas. 19 Porcentaje Inhibición 120 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 86.505 80 62.44 60 50.855 50.85 47.265 40 25.265 20 12.64 12.665 0 0 0 0 0 0 12 24 36 48 60 72 Horas de exposición Control Negativo Control Positivo Control Tween 25 ppm 75 ppm 125 ppm Figura 3. Porcentaje de inhibición de la proliferación de hongos ambientales en fragaria vesca por horas de exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus Fuente: Elaboración propia. En la Figura 3 se puede observar que tanto a las 12 y 24 horas, todos los grupos de experimentación han presentado una mismo porcentaje de inhibición del 100% de inhibición ,lo que significa básicamente que las fresas se mantuvieron inalteradas durante 24 horas, comenzando su deterioro progresivo a las 36 a diferenciarse según grupos experimentales, observándose nuevamente que el mejor perfil de inhibición de la proliferación de hongos ambientales se da con la concentración de 125 ppm, observándose diferencias para los distintos tratamientos de grupos experimentales. 20 Porcentaje de Inhibición Uno de los aspectos a destacar es el crecimiento escalonado del porcentaje de inhibición si lo comparamos según concentraciones del aceite esencial, observándose que los menores porcentaje de inhibición se encuentran en la concentración de 25 ppm luego esta sube a 75 ppm y aumenta mucho más a 125 ppm lo que sugiere que hay un efecto directamente dependiente de la concentración del aceite esencial sobre la proliferación de inhibición de hongos ambientales. Para lograr confirmar el efecto mostrado en las Figuras 1,2,3 se realizó un análisis estadístico de comparación de medias (ANOVA) y una prueba confirmativa, no paramétrica de Kruskal Wallis. Se presenta en las siguientes Tablas. Tabla 7. Análisis de varianza ANOVA de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 36, 48 y 60 horas. Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática Inhibición Entre 34606,067 5 6921,213 15185,987 ,000 36 horas grupos Dentro de 51,957 114 ,456 grupos Total 34658,024 119 Inhibición Entre 96718,681 5 19343,736 28651,057 ,000 48 horas grupos Dentro de 76,967 114 ,675 grupos Total 96795,648 119 Inhibición Entre 38691,771 5 7738,354 17980,034 ,000 60 horas grupos Dentro de 49,064 114 ,430 grupos Total 38740,835 119 21 Ho (a ≥ 0.05): La media de los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales son similares entre los grupos de experimentación. H1 (a < 0.05): Al menos una media de porcentaje de inhibición de un grupo de investigación NO es similar a los demás grupos de experimentación En la Tabla 2 se observa que el valor de significancia (a) es menor a 0.05; por lo que se acepta la H1 que indica que al menos una media de porcentaje de inhibición de un grupo de investigación NO es similar a los demás grupos de experimentación a las 36, 48 y 60 horas. Al ser los datos no paramétricos, fue necesario realizar una prueba confirmativa no paramétrica de Kruskal-Wallis para evaluar diferencia o similitudes en la distribución de los datos. 22 Tabla 8. Análisis de Kruskal-Wallis de la inhibición de la proliferación in-situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 36 horas. Rangos Agrupación N Rango promedio Inhibición 36 Control 20 70,50 horas Control positivo 20 100,50 Control tween 20 35,68 25 ppm 20 10,50 75 ppm 20 45,33 125 ppm 20 100,50 Total 120 Estadísticos de pruebaa,b Inhibición 36 horas H de Kruskal-Wallis 114,157 gl 5 Sig. asintótica ,000 a. Prueba de Kruskal Wallis b. Variable de agrupación: Agrupación 23 Ho (a ≥ 0.05): La distribución de los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales a las 36 horas es la misma entre los grupos experimentales. H1 (a < 0.05): Al menos la distribución del porcentaje de inhibición de un grupo experimental a las 36 horas NO es la misma a los demás grupos de experimentación. En la Tabla 3 se observa que el valor de significancia (a) es menor a 0.05; por lo que se acepta la H1 que indica que al menos la distribución del porcentaje de inhibición de un grupo experimental a las 36 horas NO es la misma a los demás grupos de experimentación. 24 Tabla 9. Análisis de Kruskal-Wallis de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 48 horas. Rangos Agrupación N Rango promedio Inhibición 48 Control 20 10,50 horas Control positivo 20 80,38 Control tween 20 78,53 25 ppm 20 30,50 75 ppm 20 52,60 125 ppm 20 110,50 Total 120 Estadísticos de pruebaa,b Inhibición 48 horas H de Kruskal-Wallis 111,095 gl 5 Sig. asintótica ,000 a. Prueba de Kruskal Wallis b. Variable de agrupación: Agrupación 25 Ho: (a≥0.05): La distribución de los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales a las 48 es la misma entre los grupos experimentales. H1 (a < 0.05): Al menos la distribución del porcentaje de inhibición de un grupo experimental a las 48 horas NO es la misma a los demás grupos de experimentación. En la Tabla 4 se observa que el valor de significancia (a) es menor a 0.05; por lo que se acepta la H1 que indica que al menos la distribución del porcentaje de inhibición de un grupo experimental a las 48 horas NO es la misma a los demás grupos de experimentación. 26 Tabla 10. Análisis de Kruskal-Wallis de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 60 horas. Rangos Agrupación N Rango promedio Inhibición 60 Control 20 10,50 horas Control positivo 20 110,48 Control tween 20 50,50 25 ppm 20 30,50 75 ppm 20 70,50 125 ppm 20 90,53 Total 120 Estadísticos de pruebaa,b Inhibición 60 horas H de Kruskal-Wallis 116,280 gl 5 Sig. asintótica ,000 a. Prueba de Kruskal Wallis b. Variable de agrupación: Agrupación 27 Ho: (a≥0.05): La distribución de los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales a las 48 es la misma entre los grupos experimentales. H1 (a < 0.05): Al menos la distribución del porcentaje de inhibición de un grupo experimental a las 60 horas NO es la misma a los demás grupos de experimentación. En la Tabla 5 se observa que el valor de significancia (a) es menor a 0.05; por lo que se acepta la H1 que indica que al menos la distribución del porcentaje de inhibición de un grupo experimental a las 60 horas NO es la misma a los demás grupos de experimentación. Los resultados, tanto del análisis ANOVA como de Kruskal-Wallis, nos indican que hay una clara diferencia entre los porcentajes de inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca de los grupos experimentales a las 36, 48 y 60 horas de exposición con aceite esencial de Cymbopogon citratus. Sin embargo, es importante analizar de manera específica estas diferencias y si estas se deben a la acción de una variable independiente (aceite esencial de Cymbopogon citratus) motivo por el cual, se realizaron pruebas Post-Hoc de Games-Howell cuyos resultados se muestran en las siguientes tablas: 28 Tabla 11. Pruebas Post-Hoc de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 36 horas. HSD Tukeya Grupos experimentales N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 4 25 ppm 20 50,8550 Control Tween 20 74,8000 75 ppm 20 75,4100 Control negativo 20 86,5050 Control Positivo 20 100,0000 125 ppm 20 100,0000 Sig. 1,000 ,056 1,000 1,000 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 20.000. Observando la Tabla 6, a las 36 horas las concentraciones de 25 y 75 ppm tienen un menor efecto en comparación con el control positivo. Sin embargo, cabe resaltar que el grupo control tween y el grupo 75 ppm son muy similares. Se puede estimar que el tween tiene un efecto muy similar de protección antifúngica en comparación con 75 ppm de aceite esencial de Cymbopogon citratus. Se resalta que, tanto el control positivo como la concentración de 125 ppm de Cymbopogon citratus se mantienen en un 100% de inhibición de proliferación de hongos ambientales. 29 Tabla 12. Pruebas Post-Hoc de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 48 horas. HSD Tukeya Grupos N Subconjunto para alfa = 0.05 experimentales 1 2 3 4 5 Control 20 12,6400 negativo 25 ppm 20 25,2650 75 ppm 20 60,2400 Control positivo 20 62,4400 Control tween 20 62,5750 125 ppm 20 100,0000 Sig. 1,000 1,000 1,000 ,995 1,000 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 20.000. Observando la Tabla 7, a las 48 horas las concentraciones de 25 y 75 ppm tienen un menor efecto en comparación con el control positivo. El control negativo se perfila como el que tiene el menor efecto de protección antifúngica. Sin embargo, cabe resaltar que el grupo control tween y el grupo control positivo son muy similares. Se puede estimar que el tween tiene un efecto muy similar de protección antifúngica sinérgica a tomar en consideración. Se destaca que la concentración de 125 ppm de Cymbopogon citratus se mantiene en un 100% de inhibición de proliferación sobre los hongos ambientales. 30 Tabla 13. Pruebas Post-Hoc de la inhibición de la proliferación in situ de hongos ambientales en Fragaria vesca mediante exposición del aceite esencial de Cymbopogon citratus durante 60 horas. HSD Tukeya Grupos N Subconjunto para alfa = 0.05 experimentales 1 2 3 4 5 6 Control 20 ,0000 negativo 25 ppm 20 12,6650 Control tween 20 25,1850 75 ppm 20 31,7750 125 ppm 20 47,2650 Control positivo 20 50,8500 Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 20.000. Observando la Tabla 8, al finalizar la exposición con aceite esencial de Cymbopogon citratus (60 horas), el control positivo ha prevalecido en su efecto protector antifúngica, aunque el tratamiento con la concentración de 125 ppm se aproxima, aunque son diferentes estadísticamente. Se observa que mientras la concentración del aceite esencial va aumentando el porcentaje de inhibición va incrementando, por lo que a nivel estadístico se concluye que hay un efecto directamente relacionado de la inhibición del crecimiento antifúngica con la concentración en ppm de aceite esencial de Cymbopogon citratus. 31 IV. DISCUSION 4.1. Discusión de resultados En los últimos años, el interés de los agricultores se ha centrado en la búsqueda de biofungicidas más seguros, como los aceites esenciales, para controlar las enfermedades de las plantas alimentarias en la agricultura. Los fungicidas sintéticos han sido eficaces para controlar patógenos como los del género Botrytis cinerea29; sin embargo, su uso se ha relacionado con una mayor resistencia a los patógenos y efectos sobre la salud humana y el medio ambiente30. Al mismo tiempo, un número creciente de consumidores busca productos frescos, naturales, libres de químicos y de alta calidad 31. Por lo tanto, existe la necesidad de investigaciones que aborden estas preferencias y al mismo tiempo reduzcan las pérdidas postcosecha de alimentos agrícolas como las fresas, asegurando la seguridad y el manteniendo la calidad durante el almacenamiento y el transporte, puesto que esta fruta es muy sensible a los hongos ambientales en especial al género Botrytis cinérea. En este contexto, se investigó la protección antifúngica del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a fresas (Fragaria vesca). Evaluando la protección antifúngica a una concentración de 125 ppm de aceite esencial, se ha observado un 100% de inhibición del crecimiento de los hongos ambientales sobre Fragaria vesca a las 12, 24, 36 y 48 horas de exposición del aceite esencial (Figura 2), por la que se considera como potencialmente tiene el mejor perfil a comparación de los demás grupos. Estos hallazgos son similares a los obtenidos por Oliveira Filho et al. (2021), en Brasil, el cual analizo los aceites esenciales de Mentha spicata y Cymbopogon martinii los cuales presentaron la mayor actividad antifúngica in vitro mediante los métodos de contacto directo, contacto de vapor, germinación de esporas y dilución de micropozos. Asimismo, mostraron una reducción del 100% y 83% en la incidencia de la enfermedad, respectivamente32. En consecuencia, los aceites esenciales de Cymbopogon citratus pueden ser alternativas potenciales para el control de hongos hambientales Botryti sp. en fresas frescas postcosecha. Asi mismo podemos observar que el trabajo realizado por Reang et al. (2020), en India que analizó cinco aceites esenciales, Syzygium aromaticum, Thymus vulgaris, Lavendula anguistifolia, Cymbopogon citratus y Mentha piperita, 32 evaluando el crecimiento de hongo ambientales (Botrytis cinérea) en concentraciones del 0.5%, 1% y 1.5% in vitro. Observando así que entre los cinco aceites esenciales el Thymus vulgaris mostró la máxima inhibición del crecimiento del hongo ambiental Botrytis cinérea (50%), aunque los otros aceites esenciales también mostraron inhibición del crecimiento mostrando así que los aceites esenciales son bastantes útiles ante el control de hongos ambientales. Lo mismo que, Šernaitė et al. (2020), en Lituania, demostró que el aceite esencial de clavo en la concentración más baja (200 μl/L), presento el 80% de inhibición contra el patógeno34.De forma similar, Martinazzo et al. (2019), en Brasil, realizaron pruebas in vitro de aceite esencial de Cymbopogon citratus en granos de maíz (Zea mays) infectados por Aspergillus flavus, donde la dosis de 1.0 μL/mL, mostró una inhibición del hongo al 100% 35.Sin embargo, Rguez et al. (2018), en Túnez, en pruebas in vivo controló la infección de Botrytis cinérea después de la cosecha en frutos de tomate (Lycopersicon esculentum) mediante el aceite esencial de Cupressus sempervirensse a 1 mg/mL donde mostraron una reducción alrededor del 54% en la podredumbre inducida por este patógeno36. De forma semejante, Zatla et al. (2017), en Argelia, mostraron que los tratamientos de frutos de fresa con aceite esencial de raíces de Daucus carota a concentración de 0.01 mL/L presentó una actividad protectora (100%) y preventiva (80%), frente a Botrytis cinérea37. Los aceites esenciales de plantas y sus componentes principales, monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos pueden ser una fuente interesante contra las infecciones fúngicas38. Son relativamente seguros y benignos para el medio ambiente. Cabe resaltar que muchos factores, como la región geográfica, la especie y la edad de la planta, son responsables de la alteración de los componentes químicos de los aceites esenciales y cambian los tipos y cantidades de los componentes principales39. Por lo tanto, la variedad del género Cymbopogon puede producir aceites esenciales con diferentes composiciones. El aceite esencial de Cymbopogon citratus aumenta la acidez titulable en los frutos de fresa independientemente del manejo realizado, mediante un estudio previo del contenido del aceite esencial mediante cromatografía de gases donde se encuentra presenta sustancias terpénicas como citral y mirceno17. Las sustancias terpénicas están directamente relacionadas con el color, olor y aroma de las frutas, además de ser conocidas 33 por su acción antimicrobiana y antioxidante40. Esto puede ser explicar el aumento de la acidez en las fresas que han sido tratadas con aceite esencial manteniendo así el producto viable para el consumo durante más tiempo41. A su vez se ha observado (tabla 6) que el aceite esencial a las 36 horas en concentración de 75ppm, tiene una actividad antifúngica, donde se puede observar que el tween 20 también presenta una similitud de la imbibición en la proliferación de hongos ambientales como Botrytis cinérea. Los resultados del presente estudio (figura 3) sugieren que los aceites esenciales de Cymbopogon citratus tiene efecto antifúngico in situ contra Botrytis sp. en la infección fúngica de frutos de fresa (la concentración de 125 ppm) y podrían utilizarse como tratamiento para la enfermedad de Fragaria vesca. Tomando en consideración que a la luz de los análisis estadísticos respectivos hay un alto nivel de significancia para considerar que el uso del aceite esencial de Cymbopogon citratus es una opción viable para mantener la calidad de la fruta fragaria vesca, ya que hubo protección antifúngica significativa a nivel estadístico. En resumen, nuestros resultados revelaron que los aceites esenciales de Cymbopogon citratus probados en este estudio pueden suprimir eficientemente in situ la germinación de esporas y el crecimiento micelial de los hongos ambientales (Botrytis sp). Se prepararon tres concentraciones mínimas de partes por millón, como 25ppm, 75ppm y 125ppm del aceite esencial de Cymbopogon citratus, siendo evaluados cada 12 horas, dando como resultado el que mejor protección antifúngica presento fue el de 125ppm quien demostró la misma actividad de inhibición que el fungicida agrícola comercial. A su vez sin alterar las características organolépticas propias de dicha fruta, se mantuvieron hasta las 36 horas de conservación, que posteriormente empezaron naturalmente a deteriorarse, perdiendo su color, sabor y olor, hasta cumplir las 72 horas. En consecuencia, el desarrollo de productos comerciales naturales que contengan aceites esenciales de plantas podría ser una estrategia prometedora, como ecológica, para controlar la presencia de hongos patógenos en campos de cultivo de Fragaria vesca. 34 4.2. Conclusiones - Se determinó la protección antifúngica in situ del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a hongos ambientales en la conservación postcosecha de Fragaria vesca var. Aromas - Se determinó que la concentración mínima y útil de los aceites esenciales de Cymbopogon citratus, para obtener un efecto de protección frente a hongos ambientales en Fragaria vesca es de 125 ppm. - Se determinó que los porcentajes de inhibición del crecimiento de hongos ambientales fueron del 100% con el aceite esencial de Cymbopogon citratus a la concentración de 125 ppm hasta las 60 horas de exposición, observándose a las 72 horas una disminución del 50%. - Se determinó que los porcentajes de inhibición del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre los hongos ambientales como Botrytis sp en Fragaria vesca en 60 y 72 horas fueron de 50% a 0 % respectivamente, quizás se deba a la resistencia provocado por los hongos. - Se determinó los porcentajes del 100 % en la inhibición del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre los hongos ambientales en Fragaria vesca, por 12, 24, 48 y 60 horas fueron predominantemente superiores a las de 72 horas. Es decir, la protección antifúngica se observa antes de los tres días. 35 4.3. Recomendaciones - Recomendamos una alternativa de solución al uso de fungicidas químicos peligrosos para el tratamiento de los frutos durante el almacenamiento y el transporte para reducir la infección de moho gris. Este trabajo nos llevará a otro estudio in vivo para disminuir las pérdidas de rendimiento de la producción de frutas debidas a esta enfermedad. - Recomendamos realizar otras investigaciones a temperaturas diferentes para poder mejorar u obtener un resultado mejor en cuanto a conservación postcosecha de la fresa. - Es necesario proponer que estos aceites esenciales obtenidos de Cymbopogon citratus pueden actuar eficazmente como fungicidas naturales, convirtiéndose así en una alternativa a los fungicidas sintéticos como fumigantes para la conservación de frutas comestibles frescas. - La eficacia de los aceites esenciales debe considerarse en comparación con los fungicidas tradicionales, este estudio proporcionó información para futuras investigaciones sobre el control de la podredumbre después de la cosecha utilizando aceites esenciales. - Es imperativo incorporar los aceites esenciales a partir de Cymbopogon citratus en los sistemas de manipulación postcosecha para reducir la actual dependencia de los fungicidas químicos y es necesario seguir investigando. 36 REFERENCIAS BIBLIOGRÀFICAS 1. Farhud D. Impact of Lifestyle on Health. Iran J Public Health. 2015 Nov; 44(11): 1442–1444. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4703222/pdf/IJPH-44- 1442.pdf 2. Brundtland GH. From the World Health Organization. Reducing risks to health, promoting healthy life. AMA . 2002 Oct 23-30;288(16):1974. https://doi.org/10.1001/jama.288.16.1974. 3. Cappelletti R, Sabbadini S, Mezzetti B. Strawberry (Fragaria ananassa). Methods Mol Biol. 2015;1224:217-27. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1658-0_18. 4. Guo C, Yang J, Wei J, Li Y, Xu J, Jiang Y. Antioxidant activities of peel, pulp and seed fractions of common fruits as determined by FRAP assay. Nutrition Research. 2003; 23(12):1719-1726. 5. Meyers K, Watkins C, Pritts M, Liu R. Antioxidant and Antiproliferative Activities of Strawberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003;51(23):6887-6892. 6. Gol NB, Patel PR, Rao TVR. Improvement of quality and shelf-life of strawberries with edible coatings enriched with chitosan. Postharvest Biol. Technol. 2013, 85, 185–195. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2013.06.008 7. Mitcham E J, F G Mitchell. Fresas y frutas de arbusto. Kader A. Tecnología postcosecha de cultivos hortifrutícolas. Davis, CA: Postharvest Technology Research & Information Center, UC; 2007. 8. Bhaskara Reddy M, Angers P, Gosselin A, Arul J. Characterization and use of essential oil from Thymus vulgaris against Botrytis cinerea and Rhizopus stolonifer in strawberry fruits. Phytochemistry. 1998; 47(8):1515-1520. 37 9. Benito P, Arranz M, Eslava A. Factores de patogenicidad de Botrytis cinerea. Revista iberoamericana de micología. 2000: 17:43-46. 10. Cotrina, J. Uso de Gliocladium roseum para el control de Botrytis cinerea en fresa. Tesis Título Profesional. UNHEVAL, EAP Agronomía, Huánuco, 2001. 11. Espinosa De Los Monteros, María. Estudio de la variabilidad genética y organización cromosómica en el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea. Tesis Doctoral UCA, Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales, España, 2006. 12. Almenar R, Eva M. Envasado activo de fresas silvestres. Tesis Doctoral UDV, Instituto de agroquímica y tecnología de alimentos. España, 2005. 13. Ayala-Zavala. Protección antifúngica y enriquecimiento antioxidante de fresa con aceite esencial de hoja de canela. Rev Fitotec Mex. 2013; 36(3):217–24. 14. Rivadeneira V, De Benavente H. Fundación Chankuap. Ficha técnica. Aceite esencial hierba luisa. Macas – Ecuador. 2011; 2p. 15. Trinetta V, Floros JD, Cutter CN. Sakacin a-containing pullulan film: An active packaging system to control epidemic clones of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods. J. Food Saf. 2010: 30, 366–381. https://doi.org/10.1111/j.1745-4565.2010.00213.x 16. Azaña Diaz V, Castillo Vasquez L. Caracteristica del aceite Cymbopogon citratus y determinacion del porcentaje relativo. Universidad Nacional De Trujillo; 2017. 17. Camus Ramos E, De La Cruz Ortiz N. Caracterización fisicoquìmica del aceite de Cymbopogon citratus. [Tesis]. Lima: Universidad María Auxiliadora; 2019. Disponible en: http://repositorio.uma.edu.pe/bitstream/handle/UMA/248/14.pdf?sequence= 1&isAllowed=y. 18. Espinoza I. Efecto comparativo de aceite y extracto molle sobre Botrytis cinérea. [Tesis]. Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo; 2016.Disponible en: https://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/8770/Espinoza%20 Pantigozo%2c%20Ivonne%20Kelly.pdf?sequence=1&isAllowed=y 38 19. Gamarra Reyes A. Efecto de la concentración de aceite esencial de clavo de olor en la cobertura comestible a base de gelatina en recuento de mohos y levaduras en bayas de aguaymanto. 2017. 20. Rovello A. Elaboración de un biofungicida a partir de extractos vegetales para controlar Botrytis cinerea en uva (Vitis vinifera L). 2018. 21. Camacho-Téllez Ge, Nieto-Gómez Kv. Evaluación de la capacidad antifúngica del extracto de champa sobre Botrytis cinerea y Rhizopus stolonifer en mora (Rubus glaucus). 2017;69. Disponible en: http://Repository.Lasalle.Edu.Co/Handle/10185/24791. 22. Meza K, Vargas G. Evaluación de la actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de Hierba Luisa (Cymbopogon citratus (Dc) Stapf), Poaceae en una formulación cosmética con finalidad antiacneíca. Tesis. 2013;1–100. Disponible en: http://Dspace.Ups.Edu.Ec/Bitstream/123456789/5081/1/Ups-Cyt00109.Pdf. 23. Maraví Inga G. Efecto antibacteriano y antifúngico del aceite esencial de Mentha Piperita (Menta), Origanum vulgare (Orégano) y Cymbopogon citratus (Hierba Luisa) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, Lactobacillus Acidophilus ATCC 10746 y Candida albicans ATCC 90028. Tesis. 2015;53(9):1689–99. 24. Farias P, Silva J, Souza C, Fonseca F, Brandi I, Martins E et al. Antioxidant activity of essential oils from condiment plants and their effect on lactic cultures and pathogenic bacteria. Ciência Rural. 2019; 49(2). 25. Caner, C.; Aday, M.S.; Demir, M. Extending the quality of fresh strawberries by equilibrium modified atmosphere packaging. Eur. Food Res. Technol. 2008; 227: 1575–1583. https://doi.org/10.1007/s00217-008-0881-3 26. Timudo-Torrevilla, O.E.; Everett, K.R.; Waipara, N.W.; Weeds, K.S.H.B.-W.; Langford, G.I.; Walter, M. Present status of strawberry fruit rot diseases in New Zealand. N. Z. Plant Prot. 2005, 58, 74–79. https://doi.org/10.30843/nzpp.2005.58.4257 39 27. Taborda L. Efecto fungistático de extractos y aceites esenciales de Lippia origanoides HBK y Thymus vulgaris como alternativas de manejo de Colletotrichum musae en banano y Botrytis cinerea en fresa. Tesis [Internet]. 2013;87. Disponible en: http://www.Bdigital.Unal.Edu.Co/12710/ 28. Garcia, L.C.; Pereira, L.M.; de Luca Sarantópoulos, C.I.G.; Hubinger, M.D. Effect of Antimicrobial Starch Edible Coating on Shelf-Life of Fresh Strawberries. Packag. Technol. Sci. 2011; 25: 413–425. https://doi.org/10.1002/pts.987. 29. Petrasch S, Knapp SJ, Van Kan JL, Blanco-Ulate B. Grey mould of strawberry, a devastating disease caused by the ubiquitous necrotrophic fungal pathogen Botrytis cinerea. Mol. Plant Pathol. 2019, 20, 877–892. https://doi.org/10.1111/mpp.12794. 30. Tahir HE, Zou X, Jiyong S, Mahunu GK, Zhai X, Mariod AA. Quality and postharvest-shelf life of cold-stored strawberry fruit as affected by gum arabic (Acacia senegal) edible coating. J. Food Biochem. 2018; 42, e12527. https://doi.org/10.1111/jfbc.12527. 31. Wedge DE, Curry KJ, Kreiser B, Curry A, Abril M, Smith BJ. Fungicide Resistance Profiles for 13 Botrytis cinerea Isolates from Strawberry in Southeastern Louisiana. Int. J. Fruit Sci. 2013; 13: 413–429. https://doi.org/10.1080/15538362.2013.789253 32. Oliveira Filho J, Cruz Silva G, Aguiar A, Cipriano L, Azeredo H,· Bogusz Junior S, Ferreira MD. Chemical composition and antifungal activity of essential oils and their combinations against Botrytis cinerea in strawberries. Journal of Food Measurement and Characterization. 2021; 15: 1815–1825. https://doi.org/10.1007/s11694-020-00765-x 40 33. Reang SP, Mishra JP, Prasad R. In vitro antifungal activities of five plant essential oils aginas Botrytis cinerea causing gray mold of orange. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2020; 9(3): 1046-1048. Disponible en: https://bit.ly/3vPhlzp 34. Šernaitė L, Rasiukevičiūtė N, Dambrauskienė E, Viškelis P, Valiuškaitė A. Biocontrol of strawberry pathogen Botrytis cinerea using plant extracts and essential oils. Zemdirbyste-Agriculture. 2020; 107(2): 147–152. https://doi.org/10.13080/z-a.2020.107.019. 35. Martinazzo AP, de Oliveira F, Teodoro CE. Antifungal activity of Cymbopogon citratus essential oil against Aspergillus flavus. Ciência E Natura. 2019; 41: 1-8. https://doi.org/10.5902/2179460X36055 36. Rguez S, Djébali N, Ben Slimene I, Abid G, Hammemi M, Chenenaoui S, et al. Cupressus sempervirens essential oils and their major compounds successfully control postharvest grey mould disease of tomato. Industrial Crops and Products. 2018; 123, 135–141. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.06.060 37. Tabet Zatla A, Dib MA, Djabou N, Ilias F, Costa J, Muselli A. Antifungal activities of essential oils and hydrosol extracts of Daucus carota subsp. sativus for the control of fungal pathogens, in particular gray rot of strawberry during storage. Journal of Essential Oil Research. 2017; 29(5), 391–399. https://doi.org/10.1080/10412905.2017.1322008 38. Telci I, Demirtas I, Sahin A. Variation in plant properties and essential oil composition of sweet fennel (Foeniculum vulgare Mill.) fruits during stages of maturity. Industrial Crops and Products. 2009; 30: 126–130. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2009.02.010 41 39. Dorman HJ, Deans SG. Antimicrobial agents from plants: Antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology. 2000; 88: 308– 316. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2000.00969.x. 40. Felipe LO, Bicas JL. Terpenos, aromas e a química dos compostos naturais. Quím. nova esc. – São Paulo-SP, BR, 2017;39(2):120-30. https://bit.ly/34C77pY 41. Guimarães LGL, Cardoso MG, Sousa PE, Andrade J, Vieira SS. Atividade antioxidante e fungitóxica do óleo essencial de capim-limão e do citral, Rev. Ciênc. e Agron. 2011;42 (2):464-72. https://doi.org/10.1590/S1806-66902011000200028 42. Bustamante KGL. Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto da casca da sucupira branca (Pterodon emarginatus Vogel) Fabaceae. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, 2010;12(3):341-45 https://doi.org/10.1590/S1516-05722010000300012 42 ANEXOS 43 ANEXO A. Operacionalización de variables VARIABLE DEFINICIÓN DEFINICIÓNCONCEPTUAL OPERACIONAL DIMENSIONES NATURALEZA ESCALA DE MEDIDA INDICADORES UNIDADES DEMEDICIÓN MEDIDA Fracción liquida volátil obtenida por destilación de arrastre de vapor Aceite de agua, que Concentración Porcentaje de esencial de contiene las porcentual de la − Porcentaje Cymbopogon sustancias fracción volátil de No presenta Cuantitativa De razón Directa aceite (%) citratus responsables del Cymbopogon (peso/volumen) aroma de la citratus especie Cymbopogon citratus Características − Color organolépticas Cualitativa Nominal Directa − Olor Especificaciones − Textura dadas Efecto Proporción de antifúngico in Incidencia de − Diámetro defrutos sanos que, a situ del aceite esencial de Cuantitativa Razón Directahongos crecimiento de − Milímetroslo largo del periodo ambientales Cantidad de la coloniapost-cosecha y en la frutos Cymbopogon producto de la conservación contaminados citratus humedad, son post-cosecha con hongoscontaminados con de Fragaria patógenos − Porcentaje de − Porcentaje de el hongo del control infección (%) vesca género Botrytis sp. Conservación post-cosecha de Mixta Cuali- Nominal − 0 (0%) Cuantitativa Razón Directa − 1 (5%)Fragaria vesca − Índice se − 2 (15%) severidad − 3 (45%) − 4 (75%) − 5 (100%) 44 ANEXO B. Instrumentos de recolección de datos FECHA: HORAS LUEGO DE INICIADO EL TRATAMIENTO PORCENTAJE DE INFECCION DE LA FRUTA GRUPO FRUTA 0 12 24 36 48 60 72 BLANCO A 25°C 0 0 3 1 3 13 0 CONTROL NEGATIVO A 25°C 0 0 0 1 2 17 0 CONTROL POSITIVO A 25°C 0 0 0 0 2 8 10 ACEITE ESENCIAL 125ppm A 25°C 0 0 0 0 0 5 15 ACEITE ESENCIAL 75ppm A 25°C 0 0 0 1 2 7 10 ACEITE ESENCIAL 25ppm A 25°C 0 0 0 1 2 8 9 45 ANEXO C. Porcentaje de inhibición por grupo de investigación Control Antifúngico Tween 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 1 100.0 100.0 87.5 12.5 0.0 0.0 1 100.0 100.0 100.0 62.5 50.0 0.0 1 100.0 100.0 75.0 62.5 25.0 0.0 2 100.0 100.0 85.9 13.0 0.0 0.0 2 100.0 100.0 100.0 63.0 49.0 0.0 2 100.0 100.0 74.0 62.4 24.5 0.0 3 100.0 100.0 86.0 12.4 0.0 0.0 3 100.0 100.0 100.0 63.3 50.3 0.0 3 100.0 100.0 74.6 62.5 25.6 0.0 4 100.0 100.0 85.6 12.6 0.0 0.0 4 100.0 100.0 100.0 59.0 51.0 0.0 4 100.0 100.0 75.2 63.0 26.0 0.0 5 100.0 100.0 88.0 12.7 0.0 0.0 5 100.0 100.0 100.0 62.1 51.6 0.0 5 100.0 100.0 75.3 64.0 24.8 0.0 6 100.0 100.0 87.5 12.5 0.0 0.0 6 100.0 100.0 100.0 62.4 50.4 0.0 6 100.0 100.0 74.9 61.8 24.3 0.0 7 100.0 100.0 85.9 13.0 0.0 0.0 7 100.0 100.0 100.0 62.7 50.7 0.0 7 100.0 100.0 74.8 62.0 25.6 0.0 8 100.0 100.0 86.0 12.4 0.0 0.0 8 100.0 100.0 100.0 63.2 51.6 0.0 8 100.0 100.0 73.8 62.3 25.8 0.0 9 100.0 100.0 85.6 12.6 0.0 0.0 9 100.0 100.0 100.0 63.0 50.9 0.0 9 100.0 100.0 75.0 62.5 25.5 0.0 10 100.0 100.0 85.7 12.7 0.0 0.0 10 100.0 100.0 100.0 63.8 52.0 0.0 10 100.0 100.0 74.8 62.5 23.0 0.0 11 100.0 100.0 85.5 12.5 0.0 0.0 11 100.0 100.0 100.0 62.0 52.0 0.0 11 100.0 100.0 75.0 63.0 26.3 0.0 12 100.0 100.0 87.5 13.0 0.0 0.0 12 100.0 100.0 100.0 62.5 50.0 0.0 12 100.0 100.0 75.0 62.5 25.6 0.0 13 100.0 100.0 85.9 12.4 0.0 0.0 13 100.0 100.0 100.0 62.5 51.0 0.0 13 100.0 100.0 74.0 62.4 26.0 0.0 14 100.0 100.0 88.0 12.6 0.0 0.0 14 100.0 100.0 100.0 60.0 50.3 0.0 14 100.0 100.0 74.6 62.5 24.8 0.0 15 100.0 100.0 85.6 12.7 0.0 0.0 15 100.0 100.0 100.0 63.3 51.0 0.0 15 100.0 100.0 75.2 63.0 24.3 0.0 16 100.0 100.0 85.5 12.5 0.0 0.0 16 100.0 100.0 100.0 63.4 51.6 0.0 16 100.0 100.0 75.3 64.0 25.6 0.0 17 100.0 100.0 87.5 13.0 0.0 0.0 17 100.0 100.0 100.0 62.1 50.4 0.0 17 100.0 100.0 74.9 61.8 25.8 0.0 18 100.0 100.0 85.9 12.4 0.0 0.0 18 100.0 100.0 100.0 62.4 50.7 0.0 18 100.0 100.0 74.8 62.0 25.5 0.0 19 100.0 100.0 86.0 12.6 0.0 0.0 19 100.0 100.0 100.0 62.7 51.6 0.0 19 100.0 100.0 73.8 62.3 25.0 0.0 20 100.0 100.0 89.0 12.7 0.0 0.0 20 100.0 100.0 100.0 62.9 50.9 0.0 20 100.0 100.0 76.0 62.5 24.7 0.0 100 100 86.505 12.64 0 0 100 100 100 62.44 50.85 0 100 100 74.8 62.575 25.185 0 Dosis 125 Dosis 75 Dosis 25 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 1 100.0 100.0 100.0 100.0 47.5 0.0 1 100.0 100.0 75.0 60.0 31.2 0.0 1 100.0 100.0 50.0 25.0 12.5 0.0 2 100.0 100.0 100.0 100.0 47.0 0.0 2 100.0 100.0 74.6 59.0 32.0 0.0 2 100.0 100.0 51.0 24.6 12.6 0.0 3 100.0 100.0 100.0 100.0 46.8 0.0 3 100.0 100.0 76.0 60.2 32.6 0.0 3 100.0 100.0 50.3 25.3 12.5 0.0 4 100.0 100.0 100.0 100.0 49.0 0.0 4 100.0 100.0 75.3 59.3 32.5 0.0 4 100.0 100.0 50.4 25.6 11.4 0.0 5 100.0 100.0 100.0 100.0 48.0 0.0 5 100.0 100.0 76.2 58.0 31.4 0.0 5 100.0 100.0 50.6 24.1 14.0 0.0 6 100.0 100.0 100.0 100.0 46.0 0.0 6 100.0 100.0 76.1 58.6 31.5 0.0 6 100.0 100.0 51.2 24.6 13.5 0.0 7 100.0 100.0 100.0 100.0 47.0 0.0 7 100.0 100.0 75.0 62.0 31.5 0.0 7 100.0 100.0 51.6 24.8 12.6 0.0 8 100.0 100.0 100.0 100.0 46.2 0.0 8 100.0 100.0 74.9 60.5 31.5 0.0 8 100.0 100.0 52.3 25.6 12.7 0.0 9 100.0 100.0 100.0 100.0 46.8 0.0 9 100.0 100.0 74.5 60.8 31.7 0.0 9 100.0 100.0 52.6 25.9 12.8 0.0 10 100.0 100.0 100.0 100.0 48.0 0.0 10 100.0 100.0 76.3 61.5 32.0 0.0 10 100.0 100.0 50.0 24.8 12.7 0.0 11 100.0 100.0 100.0 100.0 47.5 0.0 11 100.0 100.0 76.0 60.2 32.5 0.0 11 100.0 100.0 51.1 26.0 12.9 0.0 12 100.0 100.0 100.0 100.0 47.6 0.0 12 100.0 100.0 75.2 59.3 33.0 0.0 12 100.0 100.0 50.3 25.3 12.5 0.0 13 100.0 100.0 100.0 100.0 46.8 0.0 13 100.0 100.0 75.0 58.0 31.4 0.0 13 100.0 100.0 50.4 25.6 11.4 0.0 14 100.0 100.0 100.0 100.0 47.3 0.0 14 100.0 100.0 74.6 58.6 31.5 0.0 14 100.0 100.0 50.6 24.1 12.0 0.0 15 100.0 100.0 100.0 100.0 48.0 0.0 15 100.0 100.0 76.0 62.0 31.5 0.0 15 100.0 100.0 51.2 24.6 13.5 0.0 16 100.0 100.0 100.0 100.0 46.0 0.0 16 100.0 100.0 75.3 60.5 31.5 0.0 16 100.0 100.0 51.6 24.8 12.6 0.0 17 100.0 100.0 100.0 100.0 47.0 0.0 17 100.0 100.0 76.2 60.8 31.7 0.0 17 100.0 100.0 49.0 25.6 12.7 0.0 18 100.0 100.0 100.0 100.0 48.0 0.0 18 100.0 100.0 76.1 62.0 32.0 0.0 18 100.0 100.0 52.6 25.9 12.8 0.0 19 100.0 100.0 100.0 100.0 46.8 0.0 19 100.0 100.0 75.0 61.5 32.5 0.0 19 100.0 100.0 50.0 26.1 12.7 0.0 20 100.0 100.0 100.0 100.0 48.0 0.0 20 100.0 100.0 74.9 62.0 30.0 0.0 20 100.0 100.0 50.3 27.0 12.9 0.0 100 100 100 100 47.265 0 100 100 75.41 60.24 31.775 0 100 100 50.855 25.265 12.665 0 46 ANEXO D. Estadística descriptiva. Características estadísticas del nivel de inhibición en horas N Media Desv. Mínimo Máximo Desviación Inhibición de 12 horas 120 100,0000 ,00000 100,00 100,00 Inhibición de 24 horas 120 100,0000 ,00000 100,00 100,00 Inhibición de 36 horas 120 81,2617 17,06587 49,00 100,00 Inhibición de 48 horas 120 53,8600 28,52032 12,40 100,00 Inhibición de 60 horas 120 27,9567 18,04309 ,00 52,00 Inhibición de 72 horas 120 ,0000 ,00000 ,00 ,00 Prueba de Kolmogórov-Smirnov INH_12H INH_24H INH_36H INH_48H INH_60H INH_72H N 120 120 120 120 120 120 Parámetros Media 100,0000 100,0000 81,2617 53,8600 27,9567 ,0000 normalesa,b Desv. ,00000c ,00000c 17,06587 28,52032 18,04309 ,00000c Desviación Máximas Absoluto ,197 ,224 ,175 diferencias Positivo ,136 ,194 ,114 extremas Negativo -,197 -,224 -,175 Estadístico de prueba ,197 ,224 ,175 Sig. asintótica(bilateral) ,000d ,000d ,000d a. La distribución de prueba es normal. b. Se calcula a partir de datos. c. La distribución no tiene varianza para esta variable. La prueba de Kolmogórov-Smirnov de una muestra no se puede realizar. d. Corrección de significación de Lilliefors. Ho (a ≥ 0.05): Los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales son normales. H1 (a < 0.05): Los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales NO son normales. 47 ANEXO E. Homocedasticidad Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico gl1 gl2 Sig. de Levene Inhibición Se basa en la media 26,022 5 114 ,000 de 36 Se basa en la mediana 9,751 5 114 ,000 horas Se basa en la mediana 9,751 5 48,310 ,000 y con gl ajustado Se basa en la media 23,461 5 114 ,000 recortada Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico gl1 gl2 Sig. de Levene Inhibición Se basa en la media 11,952 5 114 ,000 de 48 Se basa en la mediana 11,237 5 114 ,000 horas Se basa en la mediana 11,237 5 57,451 ,000 y con gl ajustado Se basa en la media 11,522 5 114 ,000 recortada Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico gl1 gl2 Sig. de Levene Inhibición Se basa en la media 7,006 5 114 ,000 de 60 horas Se basa en la mediana 5,488 5 114 ,000 Se basa en la mediana y 5,488 5 90,784 ,000 con gl ajustado Se basa en la media 6,852 5 114 ,000 recortada Ho (a ≥ 0.05): La varianza de los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales son homogéneas entre los grupos de experimentación. H1 (a < 0.05): La varianza de los porcentajes de inhibición de crecimiento de hongos ambientales NO son homogéneas entre los grupos de experimentación. 48 ANEXO F. Comparaciones múltiples post-Hoc: 36, 48 y 60 horas Post-Hoc 36 horas Variable dependiente: Inhibición de 36 horas Games-Howell (I) (J) GRUPO_EXP Diferencia de Desv. Error Sig. Intervalo de confianza al 95% GRUPO_EXP medias (I-J) Límite inferior Límite superior Control Control Positivo -13,49500* ,24067 ,000 -14,2554 -12,7346 Control Tween 11,70500* ,27052 ,000 10,8791 12,5309 25 ppm 35,65000* ,31921 ,000 34,6915 36,6085 75 ppm 11,09500* ,27838 ,000 10,2492 11,9408 125 ppm -13,49500* ,24067 ,000 -14,2554 -12,7346 Control Positivo Control 13,49500* ,24067 ,000 12,7346 14,2554 Control Tween 25,20000* ,12354 ,000 24,8096 25,5904 25 ppm 49,14500* ,20970 ,000 48,4824 49,8076 75 ppm 24,59000* ,13991 ,000 24,1479 25,0321 125 ppm ,00000 ,00000 . ,0000 ,0000 Control Tween Control -11,70500* ,27052 ,000 -12,5309 -10,8791 Control Positivo -25,20000* ,12354 ,000 -25,5904 -24,8096 25 ppm 23,94500* ,24338 ,000 23,2059 24,6841 75 ppm -,61000* ,18665 ,026 -1,1704 -,0496 125 ppm -25,20000* ,12354 ,000 -25,5904 -24,8096 25 ppm Control -35,65000* ,31921 ,000 -36,6085 -34,6915 Control Positivo -49,14500* ,20970 ,000 -49,8076 -48,4824 Control Tween -23,94500* ,24338 ,000 -24,6841 -23,2059 75 ppm -24,55500* ,25208 ,000 -25,3170 -23,7930 125 ppm -49,14500* ,20970 ,000 -49,8076 -48,4824 75 ppm Control -11,09500* ,27838 ,000 -11,9408 -10,2492 Control Positivo -24,59000* ,13991 ,000 -25,0321 -24,1479 Control Tween ,61000* ,18665 ,026 ,0496 1,1704 25 ppm 24,55500* ,25208 ,000 23,7930 25,3170 125 ppm -24,59000* ,13991 ,000 -25,0321 -24,1479 125 ppm Control 13,49500* ,24067 ,000 12,7346 14,2554 Control Positivo ,00000 ,00000 . ,0000 ,0000 Control Tween 25,20000* ,12354 ,000 24,8096 25,5904 25 ppm 49,14500* ,20970 ,000 48,4824 49,8076 75 ppm 24,59000* ,13991 ,000 24,1479 25,0321 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 49 Comparaciones múltiples Variable dependiente: Inhibición de 36 horas HSD Tukey (I) (J) Diferencia Desv. Sig. Intervalo de confianza al 95% GRUPO_EXP GRUPO_EXP de medias (I- Error Límite Límite J) inferior superior Control Control Positivo -13,49500* ,21349 ,000 -14,1138 -12,8762 Control Tween 11,70500* ,21349 ,000 11,0862 12,3238 25 ppm 35,65000* ,21349 ,000 35,0312 36,2688 75 ppm 11,09500* ,21349 ,000 10,4762 11,7138 125 ppm -13,49500* ,21349 ,000 -14,1138 -12,8762 Control Control 13,49500* ,21349 ,000 12,8762 14,1138 Positivo Control Tween 25,20000* ,21349 ,000 24,5812 25,8188 25 ppm 49,14500* ,21349 ,000 48,5262 49,7638 75 ppm 24,59000* ,21349 ,000 23,9712 25,2088 125 ppm ,00000 ,21349 1,000 -,6188 ,6188 Control Tween Control -11,70500* ,21349 ,000 -12,3238 -11,0862 Control Positivo -25,20000* ,21349 ,000 -25,8188 -24,5812 25 ppm 23,94500* ,21349 ,000 23,3262 24,5638 75 ppm -,61000 ,21349 ,056 -1,2288 ,0088 125 ppm -25,20000* ,21349 ,000 -25,8188 -24,5812 25 ppm Control -35,65000* ,21349 ,000 -36,2688 -35,0312 Control Positivo -49,14500* ,21349 ,000 -49,7638 -48,5262 Control Tween -23,94500* ,21349 ,000 -24,5638 -23,3262 75 ppm -24,55500* ,21349 ,000 -25,1738 -23,9362 125 ppm -49,14500* ,21349 ,000 -49,7638 -48,5262 75 ppm Control -11,09500* ,21349 ,000 -11,7138 -10,4762 Control Positivo -24,59000* ,21349 ,000 -25,2088 -23,9712 Control Tween ,61000 ,21349 ,056 -,0088 1,2288 25 ppm 24,55500* ,21349 ,000 23,9362 25,1738 125 ppm -24,59000* ,21349 ,000 -25,2088 -23,9712 125 ppm Control 13,49500* ,21349 ,000 12,8762 14,1138 Control Positivo ,00000 ,21349 1,000 -,6188 ,6188 Control Tween 25,20000* ,21349 ,000 24,5812 25,8188 25 ppm 49,14500* ,21349 ,000 48,5262 49,7638 75 ppm 24,59000* ,21349 ,000 23,9712 25,2088 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 50 Comparaciones múltiples Variable dependiente: Inhibición de 48 horas HSD Tukey (I) (J) Diferencia Desv. Sig. Intervalo de confianza al 95% GRUPO_EXP GRUPO_EXP de medias (I- Error Límite Límite J) inferior superior Control Control -49,80000* ,25984 ,000 -50,5532 -49,0468 Positivo Control Tween -49,93500* ,25984 ,000 -50,6882 -49,1818 25 ppm -12,62500* ,25984 ,000 -13,3782 -11,8718 75 ppm -47,60000* ,25984 ,000 -48,3532 -46,8468 125 ppm -87,36000* ,25984 ,000 -88,1132 -86,6068 Control Control 49,80000* ,25984 ,000 49,0468 50,5532 Positivo Control Tween -,13500 ,25984 ,995 -,8882 ,6182 25 ppm 37,17500* ,25984 ,000 36,4218 37,9282 75 ppm 2,20000* ,25984 ,000 1,4468 2,9532 125 ppm -37,56000* ,25984 ,000 -38,3132 -36,8068 Control Tween Control 49,93500* ,25984 ,000 49,1818 50,6882 Control ,13500 ,25984 ,995 -,6182 ,8882 Positivo 25 ppm 37,31000* ,25984 ,000 36,5568 38,0632 75 ppm 2,33500* ,25984 ,000 1,5818 3,0882 125 ppm -37,42500* ,25984 ,000 -38,1782 -36,6718 25 ppm Control 12,62500* ,25984 ,000 11,8718 13,3782 Control -37,17500* ,25984 ,000 -37,9282 -36,4218 Positivo Control Tween -37,31000* ,25984 ,000 -38,0632 -36,5568 75 ppm -34,97500* ,25984 ,000 -35,7282 -34,2218 125 ppm -74,73500* ,25984 ,000 -75,4882 -73,9818 75 ppm Control 47,60000* ,25984 ,000 46,8468 48,3532 Control -2,20000* ,25984 ,000 -2,9532 -1,4468 Positivo Control Tween -2,33500* ,25984 ,000 -3,0882 -1,5818 25 ppm 34,97500* ,25984 ,000 34,2218 35,7282 125 ppm -39,76000* ,25984 ,000 -40,5132 -39,0068 125 ppm Control 87,36000* ,25984 ,000 86,6068 88,1132 Control 37,56000* ,25984 ,000 36,8068 38,3132 Positivo Control Tween 37,42500* ,25984 ,000 36,6718 38,1782 25 ppm 74,73500* ,25984 ,000 73,9818 75,4882 75 ppm 39,76000* ,25984 ,000 39,0068 40,5132 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 51 Comparaciones múltiples Variable dependiente: Inhibición de 48 horas Games-Howell (I) (J) GRUPO_EXP GRUPO_EXP Diferencia Desv. Sig. Intervalo de confianza al de medias Error 95% (I-J) Límite Límite inferior superior Control Control * Positivo -49,80000 ,25586 ,000 -50,6029 -48,9971 Control Tween -49,93500* ,14110 ,000 -50,3717 -49,4983 25 ppm -12,62500* ,17101 ,000 -13,1575 -12,0925 75 ppm -47,60000* ,30761 ,000 -48,5673 -46,6327 125 ppm -87,36000* ,04724 ,000 -87,5093 -87,2107 Control Control * Positivo 49,80000 ,25586 ,000 48,9971 50,6029Control Tween -,13500 ,28445 ,997 -1,0024 ,7324 25 ppm 37,17500* ,30041 ,000 36,2663 38,0837 75 ppm 2,20000* ,39449 ,000 1,0144 3,3856 125 ppm -37,56000* ,25146 ,000 -38,3545 -36,7655 Control Control Tween 49,93500 * ,14110 ,000 49,4983 50,3717 Control Positivo ,13500 ,28445 ,997 -,7324 1,0024 25 ppm 37,31000* ,21141 ,000 36,6744 37,9456 75 ppm 2,33500* ,33176 ,000 1,3157 3,3543 125 ppm -37,42500* ,13296 ,000 -37,8451 -37,0049 25 ppm Control 12,62500* ,17101 ,000 12,0925 13,1575 Control * Positivo -37,17500 ,30041 ,000 -38,0837 -36,2663 Control Tween -37,31000* ,21141 ,000 -37,9456 -36,6744 75 ppm -34,97500* ,34555 ,000 -36,0278 -33,9222 125 ppm -74,73500* ,16436 ,000 -75,2543 -74,2157 75 ppm Control 47,60000* ,30761 ,000 46,6327 48,5673 Control Positivo -2,20000 * ,39449 ,000 -3,3856 -1,0144 Control Tween -2,33500* ,33176 ,000 -3,3543 -1,3157 25 ppm 34,97500* ,34555 ,000 33,9222 36,0278 125 ppm -39,76000* ,30396 ,000 -40,7204 -38,7996 125 ppm Control 87,36000* ,04724 ,000 87,2107 87,5093 Control Positivo 37,56000 * ,25146 ,000 36,7655 38,3545 Control Tween 37,42500* ,13296 ,000 37,0049 37,8451 25 ppm 74,73500* ,16436 ,000 74,2157 75,2543 75 ppm 39,76000* ,30396 ,000 38,7996 40,7204 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 52 Comparaciones múltiples Variable dependiente: Inhibición de 60 horas Games-Howell (I) (J) Diferencia Desv. Sig. Intervalo de confianza al GRUPO_EXP GRUPO_EXP de medias Error 95% (I-J) Límite Límite inferior superior Control Control -50,85000* ,16929 ,000 -51,3849 -50,3151 Positivo Control Tween -25,18500* ,17491 ,000 -25,7377 -24,6323 25 ppm -12,66500* ,13636 ,000 -13,0958 -12,2342 75 ppm -31,77500* ,14634 ,000 -32,2374 -31,3126 125 ppm -47,26500* ,17279 ,000 -47,8110 -46,7190 Control Control 50,85000* ,16929 ,000 50,3151 51,3849 Positivo Control Tween 25,66500* ,24342 ,000 24,9347 26,3953 25 ppm 38,18500* ,21737 ,000 37,5314 38,8386 75 ppm 19,07500* ,22377 ,000 18,4030 19,7470 125 ppm 3,58500* ,24190 ,000 2,8593 4,3107 Control Tween Control 25,18500* ,17491 ,000 24,6323 25,7377 Control -25,66500* ,24342 ,000 -26,3953 -24,9347 Positivo 25 ppm 12,52000* ,22178 ,000 11,8526 13,1874 75 ppm -6,59000* ,22805 ,000 -7,2752 -5,9048 125 ppm -22,08000* ,24587 ,000 -22,8176 -21,3424 25 ppm Control 12,66500* ,13636 ,000 12,2342 13,0958 Control -38,18500* ,21737 ,000 -38,8386 -37,5314 Positivo Control Tween -12,52000* ,22178 ,000 -13,1874 -11,8526 75 ppm -19,11000* ,20002 ,000 -19,7102 -18,5098 125 ppm -34,60000* ,22011 ,000 -35,2622 -33,9378 75 ppm Control 31,77500* ,14634 ,000 31,3126 32,2374 Control -19,07500* ,22377 ,000 -19,7470 -18,4030 Positivo Control Tween 6,59000* ,22805 ,000 5,9048 7,2752 25 ppm 19,11000* ,20002 ,000 18,5098 19,7102 125 ppm -15,49000* ,22643 ,000 -16,1702 -14,8098 125 ppm Control 47,26500* ,17279 ,000 46,7190 47,8110 Control -3,58500* ,24190 ,000 -4,3107 -2,8593 Positivo Control Tween 22,08000* ,24587 ,000 21,3424 22,8176 25 ppm 34,60000* ,22011 ,000 33,9378 35,2622 75 ppm 15,49000* ,22643 ,000 14,8098 16,1702 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 53 Selección de la fresa y secado 54 fresas sumergidas en concentración de 125ppm 55