FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA “EFECTO GASTROPROTECTOR DEL EXTRACTO ETANOLICO DE LA HOJAS DE Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) EN RATAS ALBINAS CEPAS HOLTZMAN” TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES BACH. CIPRIAN MENDOZA, GLADYS BACH. TOMAIRO MENDEZ, LUIS ALFREDO ASESOR Mg. Q.F. FLORES LOPEZ, OSCAR BERNUY LIMA – PERÚ 2021 DEDICATORIA A mis padres por su apoyo incondicional, sus consejos, sus enseñanzas y valores; porque siempre predominó la perseverancia para alcanzar mis objetivos y metas, pero, sobre todo cumplir mis sueños. A mis 2 hijos Jerhemy y Akane que con su gran amor incondicional y ocurrencias me dan ese impulso para seguir con uno de mis sueños y demostrarme que a pesar de las circunstancias siempre hay que seguir adelante. Me ha permitido ser una persona de bien, porque son mi inspiración. A mi hermana que con su ejemplo me ha dado ese impulso para seguir con uno de mis sueños, ser una excelente profesional. A mi pareja, un hombre digno de admirar que a pesar de las cosas difíciles que le ha tocado vivir siempre ha denotado en él, ese carisma que lo caracteriza, su sonrisa. Gladys Ciprian Mendoza A Dios todopoderoso, el haberme permitido culminar con éxito esta profesión tan anhelada. A mi familia, que siempre está conmigo en los momentos difíciles, apoyándome para poder salir adelante. A mis amigos, Ana Rossi e Iván Alexis que me motivaron y guiaron para lograr este reto. Luis Alfredo Tomairo Mendez AGRADECIMIENTO A la universidad María Auxiliadora por permitirnos formar en sus aulas, donde compartimos constancia, dedicación y sobre todo esfuerzo para alcanzar nuestra primera meta. Al Mg. Q.F.Oscar Bernuy Flores López, Magister (Maestro en educación mención en investigación y docencia superior), Doctorado en Farmacia y Bioquímica (UNMSM), Egresado de Segunda Especialidad en Gestión Farmacéutica y Asuntos Regulatorios (UIGV) y asesor de nuestra tesis, quien nos brindó su plena confianza para la realización y culminación del presente trabajo, brindándonos las facilidades, orientación y mostrando la disposición, paciencia y la enseñanza a lo largo de esta investigación. A nuestros profesores que compartieron de sus conocimientos, por crear en el aula una atmósfera que nos invitó a todos a investigar, a aprender, a construir su aprendizaje y no solo a seguir lo que ellos decían o hacían. A los miembros del jurado evaluador y calificador por regalarnos su valioso tiempo y sobre todo por su dedicación profesional. A nuestros padres, pareja e hijos que me dieron el soporte para seguir estudiando. Índice General Páginas Resumen Abstract I. INTRODUCCIÓN 1 II. MATERIALES Y MÉTODOS 7 2.1 Enfoque y diseño de la investigación 7 2.2 Población, muestra y muestreo 7 2.3 Variables de investigación 8 2.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos 8 2.5 Proceso de recolección de datos 10 2.5.1. Procedimiento experimental (Etapa I) 10 2.5.1.1. Marcha fitoquímica 11 2.5.1.2. Prueba de solubilidad 13 2.5.1.3. Cromatografía 14 2.5.2. Procedimiento experimental (Etapa II) 15 2.5.2.1. Parte experimental 16 2.5.2.2. Animales de experimentación 16 2.5.2.3. Dosificación y tratamiento de las actividades 16 2.5.2.4. Observaciones y sintomatología 17 2.5.2.5. Resultado de toxicidad oral 18 2.5.2.6. Determinación de actividad Gastro protectora 19 2.6 Métodos de análisis estadístico 23 2.7 Aspectos éticos 23 III. RESULTADOS 24 IV. DISCUSIÓN 33 4.1 Discusión de resultados 33 4.2 Conclusiones 34 4.3 Recomendaciones 35 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36 ANEXOS 38 Índice de Tablas Tabla N° 01: Tratamientos de experimentación 17 Tabla N° 02: Signos y síntomas evaluados 18 Tabla N° 03: Tratamientos de experimentación 19 Tabla N° 04: Evaluación de lesiones (Según Marhuenda) 20 Tabla N° 05: Hemograma obtenido al final del tratamiento con Caléndula 21 Tabla N° 06: Solubilidades del extracto de Caléndula officinalis 24 Tabla N° 07: Marcha fitoquímica del extracto seco de las hojas de caléndula 24 Tabla Nº 08: Resultados de la Toxicidad Aguda Oral 25 Tabla Nº 09: Resumen de Observaciones después de la administración de los 26 extractos y controles Tabla Nº 10: Resultados de la actividad gastroprotectora (puntaje alcanzado) 27 Tabla Nº 11: Resultados de la actividad gastroprotectora (porcentaje alcanzado) 28 Tabla Nº 12: Análisis de Varianza 30 Tabla Nº 13: PRUEBA DE TUKEY 31 Índice de Figuras Figura N° 01: % Actividad Gastroprotectora en ratas inducidas tratadas con 28 Caléndula Figura N° 02: Valoración de la ulceración según Marhuenda en ratas 29 inducidas tratadas con Caléndula Figura Nº 03: % de efectividad en ratas inducidas tratadas con Caléndula 32 Índice de Anexos Anexo A: Operacionalización de las variables 39 Anexo B: Clasificación taxonómica 40 Anexo C: Evidencias fotográficas del trabajo de laboratorio 41 Anexo D Evidencias fotográficas del trabajo de campo 62 Anexo N° 1: Recolección de la especie botánica Caléndula officinalis 41 (Caléndula). Anexo N° 2: Imagen que muestra a la planta de la caléndula, sus flores 41 y hojas. Anexo N° 3: Altura y crecimiento de la planta de Caléndula officinalis L. 42 (Caléndula). Anexo N° 4: Preparación del extracto etanólico. 42 Anexo N° 5: Preparación para marcha fitoquímica. 43 Anexo N° 6: Resultado de marcha fitoquímica. 43 Anexo N° 7: Pesado de los animales de experimentación. 44 Anexo N° 8: Administración de etanol a los animales de experimentación. 44 Anexo N° 9: Disección de los animales de experimentación. 45 Anexo N° 10: Corte para visualizar el estómago de los animales de 45 experimentación inducidos a lesiones gástricas. Anexo N° 11: Eutanasia y disección de la rata. 46 Anexo N° 12: Extracción del estómago para la apertura por la línea del 46 tercio inferior Anexo N° 13: Control negativo: Grupo sin tratamiento con formación de 47 ulceras con puntaje 3 con hemorragia y necrosis. Anexo N° 14: Daño en el estómago con edema e infiltración generalizada 47 sin tratamiento. Anexo N° 15: Dosis de 250 mg/kg: Puntaje 3 con formación de ulceras 48 perforadas de longitud menos de 5mm y diámetro menor de 2 mm Anexo N° 16: Ulceras hemorrágicas menores de 2mm 48 Anexo N° 17: Dosis de 500 mg/kg: Puntaje 1 con formación de menos de 49 4 ulceras de grado 3. Anexo N° 18: Formación de ulceras hemorrágicas de menos de 2 mm de 49 diámetro Anexo N° 19: Dosis de 1000 mg/kg, puntaje 1 con formación de una ulcera 50 fina menor de 1mm Anexo N° 20: Control positivo, con tratamiento con Omeprazol 40 mg/kg 50 y puntaje 0 Anexo N° 21: Certificado de las ratas albinas Holtzman 51 Anexo N° 22: Hoja de validación de instrumentos al 250 mg/kg 52 Anexo N° 23: Hoja de validación de instrumentos al 500 mg/kg 55 Anexo N° 24: Hoja de validación de instrumentos al 1000 mg/kg 58 Anexo N° 25: Hoja de validación de instrumentos – Grupo experimental 61 RESUMEN La investigación se llevó a cabo para determinar el efecto gastroprotector del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. Las hojas de caléndula tienen importantes propiedades que pueden ser empleadas en la industria farmacéutica. Adicionalmente se han encontrado sustancias con un alto efecto gastroprotector. El extracto etanólico se obtuvo mediante extracción por maceración en un periodo de una semana que se obtuvo un rendimiento en base seca mayor al 30 % . La investigación tuvo como objetivo determinar el efecto gastroprotector del extracto etanólico de las hojas de «Caléndula». La muestra se administró mediante sonda nasogástrica a diferentes niveles de dosis en un total de 21 ratas albinas machos cepa Holtzman, 7 ratas control positivo y 7 ratas control negativo, de acuerdo con el procedimiento del Manual de Técnicas de Investigación del CYTED. Se usaron ratas albinas machos (cepa Holtzman) de 8 - 10 semanas de edad con un peso promedio de 220 - 250 g; provenientes de las instalaciones del bioterio de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El proceso de cuarentena para la aclimatación a las condiciones ambientales y conductuales será de cinco días. En los resultados de obtenidos para cada concentración existió presencia de metabolitos como flavonoides, alcaloides, compuestos fenólicos. Con una concentración de 1000mg/kg con un porcentaje de eficacia al 80% y en comparación con el Omeprazol, se pudo evidenciar que las concentraciones ensayadas de 1000 mg/kg., 500mg/kg y 250 mg/kg. tienen un efecto gastroprotector y significante pero que no superan al Omeprazol con 100%. Palabras claves: Efecto gastroprotector, extracto etanólico, omeprazol, Caléndula officinalis. ABSTRACT The research was carried out to determine the gastroprotective effect of the ethanolic extract of the leaves of Calendula officinalis L. Calendula leaves have important properties that can be used in the pharmaceutical industry. Additionally, substances with a high gastroprotective effect have been found. The ethanolic extract was obtained by extraction by maceration in a period of one week, which obtained a yield on a dry basis greater than 30%. The objective of the investigation was to determine the gastroprotective effect of the ethanolic extract of the leaves of «Calendula». The sample was administered by nasogastric tube at different dose levels in a total of 21 Holtzman strain male albino rats, 7 positive control rats and 7 negative control rats, according to the procedure of the CYTED Research Techniques Manual. Male albino rats (Holtzman strain) 8-10 weeks old with an average weight of 220-250 g were used; from the facilities of the animal farm of the Peruvian University Cayetano Heredia. The quarantine process for acclimatization to environmental and behavioral conditions will be five days. In the results obtained for each concentration, there was the presence of metabolites such as flavonoids, alkaloids, phenolic compounds. With a concentration of 1000mg / kg with an efficacy percentage of 80% and in comparison, with Omeprazole, it was possible to show that the concentrations tested of 1000mg / kg., 500mg / kg and 250mg / kg. They have a significant and gastroprotective effect but do not exceed Omeprazole with 100%. Keywords: Gastroprotective effect, ethanolic extract, omeprazole, Calendula officinalis. I. INTRODUCCIÓN La ubicación geográfica del Perú y su diversidad climática permiten a las personas cultivar una variedad de plantas medicinales, algunas de las cuales se consideran innovadoras y esperanzadoras para el desarrollo del país. Estas plantas son consideradas como productos potencialmente atractivos en el mercado internacional, con nuevas propiedades sensoriales, médicas y nutricionales, gran potencial de demanda y altas posibilidades comerciales a mediano y largo plazo. En nuestro país, un estudio realizado durante 2016-2019, mostró que la tasa de prevalencia de ulcera péptica por cada 1000 pacientes sintomáticos sometidos a endoscopia era del 83,09 % que es el caso más común de ulcera duodenal. Sin embargo, las ulceras gástricas han ido en aumento en los últimos años, que se caracterizan por un elevado sangrado e indigestión. Entre las plantas prometedoras se encuentran las hojas de la Caléndula officinalis L. (Caléndula) es una planta cultivada principalmente en la sierra norte del Perú. Estas hojas son cotizaciones naturales, consideradas por locales y extranjeros como una alternativa prometedora a la protección del estómago, y son un elemento esencial del desarrollo sostenible en estas áreas. El uso de las plantas medicinales se ha dado desde hace mucho tiempo. Las diferentes culturas han logrado su propia flora terapéutica, la cual se ha transmitido por tradición oral por generaciones. La biodiversidad para nuestro país toma importancia por sus especies vegetales, de las 5000 plantas utilizadas 4000 son nativas y solo 600 son de fuera. El total de estas plantas se aplican en 49 casos diferentes, de todos ellos 1400 son de uso medicinal. El uso de la medicina alternativa, en los países desarrollados es cada vez mayor; en cuanto a los países en vía de desarrollo es frecuente su uso ya que económicamente le es factible. (1-2) 1 La Organización Mundial De La Salud, promueve entre sus estados miembros la incorporación y el uso de las plantas medicinales bajo la denominación de medicina tradicional trazándose objetivos básicos como el de introducir en los sistemas nacionales de salud la medicina tradicional, así como su uso racional, mejorar el acceso y la disponibilidad, promoviendo a su vez la calidad, efectividad y seguridad de la medicina tradicional ampliando la base de conocimientos. (3) La úlcera péptica es una enfermedad relativamente frecuente y heterogénea, debido a diversos factores; bacterianos, farmacológicos, psicológicos, estilo de vida, ambientales y anatómicos, que en combinación o aisladamente hacen un desequilibrio entre los componentes defensivos y agresivos de la mucosa gastroduodenal, lo que conduce a una lesión de estómago y/o duodeno. (4) Por su preferencia relativa de esta enfermedad es necesario su prevención y tratamiento, desarrollándose así una serie de medicamentos bien para reducirla o eliminarla. En el Perú, la gastritis crónica es una de las principales causas de consulta médica. (5) Algunas plantas medicinales se utilizan en nuestro país con propiedades gastroprotectoras, incluida la investigación de sus efectos farmacológicos, como el matico (6), sangre de grado, aloe (7), achiote (8), etc. Las plantas prometedoras incluyen las hojas de Caléndula officinalis L. (CALENDULA), que crecen principalmente en las tierras altas del norte de Perú. Basándonos en estudios ya realizados que los usaremos en nuestro trabajo de investigación como antecedentes nacionales e internacionales, se muestran a continuación: Inocente T. (2017). Mutisia acuminata es una especie botánica que posee folclóricamente propiedades antiulcerativas, por lo tanto, se estudió su actividad. La metodología usada fue la obtención de hojas y preparar extracto hidroalcohólico, con la marcha fitoquímica se determinó la presencia de metabolitos secundarios y con la técnica de Lee 1979 se evidencio la actividad anti ulcerativa en varias 2 concentraciones preparadas, la evidencia farmacológica se reportó en ratas albinas 64 animales con los cuales se formaron 8 grupos de 8 animales y el fármaco ulcerativo fue naproxeno. Los resultados mostraron que el extracto exhibía actividad a 400 y 600 mg/kg. En comparación con el grupo estándar de ranitidina y omeprazol, el efecto inhibidor de la úlcera gástrica fue del 68% y 82%, respectivamente, y el efecto inhibidor de este último fue del 64%. La conclusión es que cuando la concentración es de 400y 600 mg/kg, Mutisia acuminata tiene un efecto gastroprotector. (9) Reyes L. (2019). Realizó el estudio “efecto gastroprotector del extracto hidroalcohólico de Vaccinium corymbosum (arándano) sobre las úlceras gástricas inducidas en Rattus norvegicus var. Albinus”. Usaron 24 ratas con peso entre 220 – 240 g distribuidos en 4 grupos, el primero recibió agua a voluntad, el segundo indometacina 120 mg/Kg vía intraperitoneal, el tercero ranitidina 100 mg/Kg vía oral + indometacina 120 mg/Kg y el cuarto grupo arándano 600 mg/Kg + indometacina 120 mg/Kg. Hallaron que en el grupo del arándano disminuyó el número de úlceras en forma significativa respecto al grupo control indometacina. Concluyen que el arándano tuvo efecto gastroprotector en ratas en ratas inducidas a úlcera gástrica. (10) Coronel E. (2016). Empleó Linum usitatissimum (linaza) para evaluar el efecto protector sobre la mucosa gástrica. La metodología usó el modelo experimental de Robert 1979 el cual emplea etanol al 70% para logar el efecto sobre la membrana a una dosis de 10 ml/kg. Se emplearon ratas albinas como sujetos de experimentación los cuales fueron divididos en 6 grupos experimentales a los cuales fueron administrados las diferentes concentraciones de linaza y el control positivo. Los resultados según la evaluación por la escala de Marhuenda, demostraron que la linaza posee efecto gastro protector, provocando la regeneración de la mucosa y mejorando las lesiones provocadas por la sustancia irritante administrada. Se concluye que una medida para tratar la ulcera gástrica concomitante es la Linum usitatissimum (Linaza) (11) Pandey S, et al. (2018). Desarrollaron el estudio “in vitro, in vivo de la actividad antiulcerosa del ácido ferúlico”. Emplearon extracto etanólico del ácido ferúlico obtenido de plantas medicinales, en tres niveles de dosis; 10 mg/kg, 20 mg/kg y 40 3 mg/Kg. Para provocar úlcera gástrica usaron el método de ligadura de píloro, y método químico inducido por etanol, histamina y ácido acetil salicílico. Evidenciaron que el ácido ferúlico disminuyó la secreción del ácido clorhídrico, disminuyó la peroxidación lipídica y el índice de úlcera, comprobaron que aumento del pH e inhibió a la enzima ATPasa K+/H+. Concluyen que el ácido ferúlico presentó actividad antiulcerosa en ratas albinas. (12) Shukla I, et al. (2019). Desarrollaron el estudio “efecto gastroprotector de la formononetina contra la ulceración gástrica inducida por etanol en ratas mediante el aumento de marcadores citoprotectores y la reducción de la expresión del gen apoptótico”. Emplearon la FMN (formononetina) es una isoflavona del trébol rojo. Usaron ratas albinas, fueron divididas en 5 grupos; Los primeros tres grupos recibieron FMN (25 mg / kg, 50 mg / kg y 100 mg / kg), el cuarto grupo recibió omeprazol 20 mg / kg y el quinto grupo recibió etanol absoluto 5 ml / kg, todos los cuales se tomaron oralmente. Luego de una hora de la administración del inductor de úlcera gástrica (etanol) las ratas fueron sacrificadas, se realizó análisis bioquímico, microscópicos y macroscópicos. Hallaron, que el FMN aumentó los niveles de glutatión y disminuyó los niveles de malondialdehído, asimismo se observó citoprotección frente a úlceras gástricas, se restableció los niveles de óxido nítrico, en análisis histológicos se observó inhibición de lesiones gástricas en ratas tratadas con FMN. (13) Sanalkumar K, et al. (2018). Desarrollaron el estudio “efecto antiulceroso del extracto de rizoma de Curcuma longa L contra úlcera péptica inducida por aspirina en ratas”. Elaboraron un extracto hidroalcohólico con etanol 50% del rizoma Curcuma longa L, en el equipo extractor Soxhlet. Usaron ácido acetil salicílico 500 mg/kg con agente químico para estimular úlcera gástrica a ratas Wistar. La ranitidina 50 mg/Kg fue empleado como fármaco control positivo, las dosis del extracto fueron; 250 mg/kg, 500 mg/kg y 1000 mg/Kg. Hallaron que el extracto protegió la mucosa gástrica de manera significativa frente a la inducción de úlcera gástrica, probablemente por acción sinérgica de los taninos, alcaloides, triterpenos y flavonoides identificados en el extracto. Concluyen que el extracto del rizoma de C. longa tuvo efecto antiulceroso en ratas albinas inducidas a úlcera gástrica. (14) 4 El presente trabajo contribuirá con el conocimiento sobre la actividad del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) en ratas albinas cepas Holtzman, en el tratamiento de la úlcera gástrica, por tanto, ayudará a hacer frente al aumento de la farmacorresistencia en el plan de tratamiento actual proponiendo nuevas alternativas de tratamiento. Aportaremos evidencias científicas sobre el manejo terapéutico del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) en ratas albinas cepas Holtzman en la población y se orientará su producción con fines terapéuticos. La biodiversidad de plantas medicinales permitirá su uso para la prevención y el tratamiento de enfermedades en este caso el tratamiento de la úlcera gástrica; ofreciéndonos un potencial único para el descubrimiento y desarrollo de agentes bioactivos. (15) Los resultados de este trabajo de investigación brindarán respaldo científico para el uso seguro de las plantas estudiadas y beneficiarán a los productores y vendedores del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALENDULA) generarán mayor demanda por su efectividad. Aportando a la industria farmacéutica y a la comunidad científica, e incentivando futuras investigaciones para beneficiar a los pacientes que padecen úlcera gástrica. El objetivo de este estudio es determinar el efecto gastroprotector del extracto etanólico de hojas de Caléndula officinalis L. (CALENDULA), diseñado para promover el conocimiento científico y encontrar posibles metabolitos secundarios en función de la concentración. Se expresa en porcentaje y proporciona una base para la posibilidad de formular y desarrollar fármacos orales a partir de los principios efectivos responsables de esta característica. Este estudio se comparó con el efecto gastroprotector del omeprazol. 5 Los objetivos específicos son: ✓ Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA). ✓ Determinar la concentración del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) con efecto gastroprotector en ratas albinas cepa Holtzman. ✓ Comparar el efecto gastroprotector del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) y el fármaco de Omeprazol en ratas albinas cepa Holtzman. Se establece la siguiente hipótesis en el estudio: El extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) presenta efecto gastroprotector en ratas albinas cepa Holtzman. 6 II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 ENFOQUE Y DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN Cuantitativo por su enfoque, ya que la investigación comprobó la hipótesis aplicando análisis estadístico. Experimental: se manipulará la variable dependiente. Transversal por su temporalidad, porque el estudio evaluó las muestras una sola vez y en un determinado momento. Aplicada por su propósito, porque el estudio se llevó a cabo de forma práctica a través de procesos experimentales. 2.2 POBLACIÓN Y MUESTRA Población: Constituida por tres kilogramos de hojas Caléndula oficinales L. (CALÉNDULA) de la provincia de Carhuaz, ubicado a 34 km del departamento de Ancash a una altura de 2688 m.s.n.m. Muestra: Muestra Vegetal: Se usarán 3 kg de las hojas de Caléndula officinalis “CALÉNDULA” de una parcela de 15m2 de diámetro donde se desarrollan en estado silvestre. Muestra animal: En cuanto a la unidad de análisis se utilizaron Treinta y seis ratas albinas machos (cepa Holtzman) de 6 – 8 semanas de edad con un peso promedio de 220 + 20 g. La muestra que se utilizó estuvo conformada de 6 grupos de 5 ratones cada uno formados al azar, recibiendo cada grupo un tratamiento distinto. 7 2.3 VARIABLES DE INVESTIGACIÓN En el siguiente estudio se presentará como variable principal nuevas oportunidades de tratamiento, es una variable cuantitativa y su escala de medición es longitudinal. Variable independiente: Extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L (Caléndula). Definición conceptual: Producto obtenido por maceración, para la extracción de compuestos bioactivos, concentrado, conservado y almacenado en envase ámbar. Administrado en diversas concentraciones. Definición operacional: Maceración en alcohol 70% por 10 días, para la extracción de compuestos bioactivos y luego concentrado en estufa a 40 °C Variable dependiente: Efecto Gastroprotector Definición conceptual: Actividad gastroprotector del Extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L (Caléndula). Definición operacional: Evaluación del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (Caléndula). 2.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN D DATOS Para la recolección de la información se utilizó la ficha Ad doc. Elaboradas por el investigador para todos los procesos experimentales, registrando los datos obtenidos los cuales permitieron llegar a posibles conclusiones. Equipos e instrumentos Para el trabajo se utilizaron los siguientes equipos: • Balanza gramera. - para el pesado de las ratas albinas. • Balanza analítica. - para el pesado de las hojas de “Caléndula” • Estufa. - para el secado de las hojas de “Caléndula” • Rotavapor. - para la extracción de alcohol de las hojas de ““Caléndula” 8 Materiales Para el trabajo se utilizaron los siguientes materiales: • Material estéril de Laboratorio • Papel Kraft • Matraz Erlenmeyer • Embudo • Papel filtro • Tubos de ensayo • Pipetas Reactivos Para el trabajo se utilizaron los siguientes reactivos: • Reactivo de Mayer • Reactivo de gelatina al 1% • Reactivo de Reineckato • Reactivo de Sonneschein • Reactivo de Wagner • Reactivo de Cloruro Férrico • Reactivo de Shinoda (magnesio + ácido clorhídrico concentrado) • Reactivo de Dragendorff • Alcohol de 96°C • Etanol • Cloroformo • Agua destilada • Isopropanol • Metanol • Reactivo de Tricloruro de Aluminio al 2% • Acetato de sodio 1 M • Estándar de Quercetina • Omeprazol 9 2.5. PROCESO DE RECOLECCIÓN DE DATOS Los datos fueron analizados por el sistema estadístico SPSS para determinar la significancia de los datos y determinar la robustez del proceso investigativo. Se desarrollo un ANOVA para determinar las pruebas paramétricas de varianza, media y promedio, finalmente se determinó el p=valor para la significancia entre grupos. 2.5.1. Procedimiento experimental (etapa I) • Secado de las hojas de “Caléndula” Se procedió a separar las hojas de las ramas con cuidado y recolectarlas, se lavaron con agua destilada para quitarle toda la suciedad, luego se pone en papel Kraft para luego ser llevado a la estufa a una temperatura de 40 °C; se utilizó esta temperatura para no alterar los metabolitos que queremos evaluar. Se pesó un total de 500 gramos de hojas de Caléndula officinalis “Caléndula”. • Extracción etanólica de las hojas de “Caléndula” Una vez ya secas las hojas de la Caléndula se colocaron en un recipiente adecuado para verter el solvente de etanol con lo cual se extrajo los metabolitos que pueden tener, la muestra se maceró por una semana (7 días) con agitación constante y protegidos de la luz para no alterar los metabolitos. Después del tiempo transcurrido la muestra se filtró con papel Whattman #40, para no dejar pasar las hojas y si solo líquido para nuestros análisis posteriores. (16) • Extracto seco de las hojas de “Caléndula” Para el procedimiento del extracto seco se llevó el extracto filtrado al rotavapor, equipo que fué utilizado para la evaporación del solvente; este equipo consta de una vasija de calentamiento donde pusimos el agua destilada, un brazo que sujeta el balón donde fué depositada la muestra y al otro extremo un refrigerante que tiene una terminación para el recojo del alcohol en la muestra. Este trabajo fué a una temperatura controlada que no debe de exceder los 50°, después de un tiempo transcurrido la muestra fue llevada a la estufa a 40° donde se obtuvo el extracto seco que formó melcocha (extracto seco). 10 La muestra fue recolectada en envase protegido de la luz y guardada a temperatura de 2 a 8 °C hasta su utilización para la prueba de solubilidad, marcha fitoquímica y dosificación para el efecto Gastroprotector. 2.5.1.1. Marcha Fitoquímica Es una de las pruebas más importantes de las ciencias farmacéuticas para determinar las propiedades farmacológicas que posee una especie botánica mediante la determinación de sus metabolitos activos. Para ello es necesario obtener la parte útil de la planta, aquella que contenga la mayor cantidad de principios activos y extraerlos por diferentes métodos utilizando solventes de diferentes polaridades. Son pruebas de precipitación y coloración de tipo cualitativo, el extracto es sometido a la acción de diferentes reactivos y estos a su vez revelan la presencia del analito fitoquímico. Los metabolitos primarios son compuestos que las plantas utilizan para su crecimiento y desarrollo sin propiedades terapéuticas para el ser humano sin embargo los metabolitos secundarios son los productos de desechos que excretan las plantas pero que poseen propiedades farmacológicamente importantes y en algunas condiciones muy enérgicas (toxicas) La prueba consiste en preparar una batería de tubos de ensayos y colocar en ellos una alícuota del extracto y enseguida los reactivos para cada uno de los grupos químicos a analizar. • Prueba para Alcaloides: Este ensayo es de tipo cualitativo de precipitación, en el se puede determinar la presencia de alcaloides según la reacción química entre el reactivo y el sustrato correspondiente. Para dar como positivo la presencia del metabolito es necesario que al menos 4 de las reacciones den positivas. ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. De Mayer. - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Mayer. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado blanco cremoso. 11 ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. De Reineckato. - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Reineckato. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado floculante de color rosa. ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. De Sonneschein - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Sonneschein. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado de color naranja. ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. De Wgner - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Wagner. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado de color marrón ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. De Dragendorff - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Dragendorffr. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado de color naranja. • Prueba para Taninos: ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. de Gelatina - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de gelatina. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado de color blanco • Prueba para Flavonoides: ➢ Reacción de coloración con Rvo. de Shinoda - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de shinoda. La presencia positiva estará determinada por la formación de un color roja para flavonoles y algunas veces azul o verde son consideradas positivas. Las chalconas y auronas dan coloración roja directamente por adición de ácido clorhídrico concentrado. • Prueba de Compuestos Fenólicos: ➢ Reacción de coloración con Rvo. Cloruro Ferrico.- alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de FeCl3. La presencia positiva estará determinada por la formación de un color azul, verde o negra. 12 Metabolitos Primarios A.- Prueba para Azucares. ➢ Reacción de coloración con Rv Fehling A y B.- alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Fehling A y B, luego baño maría. La presencia positiva estará determinada por la formación de un color anaranjado ladrillo. B.- Prueba para Almidón. ➢ Reacción de coloración con Rv Lugol. - alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de Lugol. La presencia positiva estará determinada por la formación de un color azul oscuro C.-Prueba para Cetonas. ➢ Reacción de Precipitación con Rvo. 2,4 Dinitrofenilhidrazina (DNPH) alícuota de la muestra de estudio más 5 gtas del Rvo. de 2,4 DNPH. La presencia positiva estará determinada por la formación de un precipitado amarillo o naranja rojizo. Los resultados fueron los siguientes. Ver tabla N° 7 2.5.1.2. Prueba de solubilidad: Para la prueba de Solubilidad tuvimos que contar con el extracto seco de Caléndula officinalis “Caléndula”. Tomamos una pequeña cantidad de muestra seca y la colocamos en los tubos de ensayo para luego verter unos 3 a 5 mL de los solventes como (Alcohol de 96°, Metanol, Cloroformo, Agua e Isopropanol) esta prueba nos da referencia en que solventes es más soluble la muestra a tratar. Debemos tener en cuenta la Polaridad del disolvente por que este le da propiedades de solubilización a diferentes solutos. Ver tabla N° 6 13 2.5.1.3. Cromatografía Son técnicas analíticas simples, se puede realizar con muy poca muestra, es una técnica ampliamente usada en los controles de toda clase de productos naturales. También puede ser empleado como ensayo semicuntitativo comparando las intensidades de las manchas visualizadas con patrones adecuados. La detección de los compuestos separados generalmente se realiza por métodos generales o específicos, la luz UV permite detectar sustancias que absorben a la longitud de onda larga 365nm y de onda corta a 254 nm. A.- Cromatografía en capa fina para Alcaloides Para la prueba de cromatografía en capa fina para alcaloides se usó la placa Cromatográfica de la marca Merck (TLC Silica gel F254) como fase estacionaria, para la fase móvil se usó el diluyente de elución de Metanol: Agua en proporción de (25:75) respectivamente. Para la comparación se usó un estándar de Cafeína en concentración de 10 mg/ mL el cual se inyecto 5 µl, caso similar con la muestra de Caléndula officinalis “Caléndula”. En la placa Cromatográfica se aplica 5 µl del estándar y de muestra y una vez terminada la corrida se seca la placa en la plancha de calentamiento hasta evaporar todo el solvente, caso seguido se evidencia las manchas de desplazamiento en la luz UV 254 nm. Para la identificación de alcaloides en la muestra se rocía ácido sulfúrico al 2 % y luego el reactivo de Dragendorff, como revelador, para una evidencia positiva se tiene que ver manchas naranjas. Las muestras de Caléndula officinalis “Caléndula”, dio positivo para alcaloides. B.- Cromatografía en capa fina para flavonoides Para la prueba de cromatografía en capa fina para alcaloides se usó la placa cromatográfica de la marca Merck (TLC Silica gel F254) como fase estacionaria, para la fase móvil se usó el solvente de elución de Butanol: Agua: Ácido acético glacial en proporción de (20:15:5) respectivamente, esta mezcla se colocó en una pera de bromo de 250 mL y se agito, se evidencia la formación de dos fases, la fase móvil es la menos densa. 14 Para la comparación se usó un estándar de Quercetina en una concentración de 10 mg/ mL el cual se inyecto 5 µl a la placa Cromatográfica, caso similar con la muestra de Caléndula officinalis “Caléndula”. En la placa Cromatográfica se aplica 5 µl del estándar y de muestra una vez terminada la corrida la muestra es secada en una plancha de calentamiento, hasta evaporación del solvente, se evidencia las manchas en la luz UV a 254 nm, y se usa como revelador el tricloruro de aluminio, para una muestra positiva es característico de manchas amarillas. La muestra de Caléndula officinalis “Caléndula” dio positivo para flavonoides. 2.5.2. Procedimiento experimental (etapa II) El presente trabajo tuvo como objetivo primero la determinación de la Toxicidad Aguda Oral en ratas, para analizar si el extracto etanólico de la “Caléndula” causa mortalidad o signos adversos en los animales de experimentación y segundo la determinación de la Actividad gastroprotectora del extracto del en estudio. En los ensayos realizados la administración del extracto fue por la vía oral. En la prueba farmacológica el extracto fue administrado mediante sondas nasogástricas a diferentes niveles de dosis en un total de 30 ratas albinas machos (250, 500 y 1000 mg/kg de peso corporal), 5 ratas control positivo (Omeprazol 20 mg/kg), 5 ratas inducidas sin tratamiento y 5 ratas control negativo (normales) todas de la cepa Holtzman, de acuerdo con el procedimiento citado en el Manual de Técnicas de Investigación del CYTED. (17) Se realizaron observaciones del proceso ulcerativo generado por la administración de un agente ulcerogénico, que fue el etanol absoluto, en una proporción de 1ml/ 200g por 7 días. Al otro día después de la inducción el extracto etanólico en estudio fue administrado por 21 días por vía oral a los animales de experimentación y se evaluó el efecto gastroprotector ante los daños generados en la inducción. 15 El extracto etanólico de Caléndula (Caléndula officinalis) presenta Actividad Gastroprotectora en el modelo estudiado, a las dosis de 250, 500 y 1000 mg de muestra/Kg peso corporal. 2.5.2.1. Parte experimental: Se determinó la Toxicidad Aguda por vía oral en ratas, según Guía OECD – Test 423 y la evaluación Gastroprotectora por vía oral del extracto etanólico de Caléndula (Caléndula officinalis L.) mediante la técnica citada en el Manual del Cyted.(18) 2.5.2.2. Animales de experimentación Fueron usadas ratas albinas machos (cepa Holtzman) de 8 - 10 semanas de edad con un peso promedio de 220 - 230 g; provenientes de las instalaciones del Bioterio de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El proceso de cuarentena para la aclimatación a las condiciones ambientales y conductuales fue de cinco días. El total de animales fueron distribuidos en tres grupos de 3 ratas con una repetición y un control, para la prueba de toxicidad y otros 6 grupos de 5 animales por tratamiento, con un grupo control, para la prueba farmacológica. En total 36 animales para todo el ensayo. Los procedimientos aplicados en el cuidado de los animales usados durante la prueba cumplen con las directivas aceptadas en las Normas o Guías Internacionales para el Cuidado y Manejo de los animales de experimentación. El control adecuado de las condiciones ambientales y las técnicas adecuadas del cuidado animal son necesarios para dar resultados significativos. La alimentación se realizó con alimento balanceado para roedores y agua ad libitum. 2.5.2.3. Dosificación y tratamiento de animales: • Toxicidad aguda oral La prueba incluyó un tratamiento con una repetición y un grupo control. La dosis tratada fue de 2000 mg de producto/Kg de rata. El volumen de administración del extracto Etanólico fue de 1 mL. La muestra fue disuelta con agua destilada y administrada en dosis única, mediante el uso de una sonda nasogástrica. 16 La mortalidad fue observada diariamente hasta los 14 días. Adicionalmente se realizaron observaciones diarias para ver si hubo mortalidad o si se produjeron efectos adversos durante todo el tratamiento. Los tratamientos y sus respectivos valores de concentración ensayados son detallados en la siguiente Tabla: Tabla N° 01: Tratamientos de experimentación Dosis ((mg / Kg pc) N° de animales Machos Peso por grupos (g) 2000 3 222.18 2000 (repetición) 3 224.76 Control 3 227.84 Fuente: Elaboración propia 2.5.2.4. Observaciones y Sintomatología Cada animal fue sacado de su jaula durante los 14 días de evaluación, para realizar la observación que incluyó: comportamiento general, piel, ojos, hocico, cavidad oral, abdomen, y genitales externos. 17 Tabla N° 02: Signos y síntomas evaluados PARAMETROS /RESPUESTA AGUA ALCOHOL OMEPRAZOL MP MP MP 1OOOmg/kg 500mg/kg 250mg/kg ↑SNC ACTIVIDAD MOTORA Temblores finos en el cuerpo Temblores fuertes en el cuerpo Fasciculaciones Convulsiones clónicas Convulsiones tónicas Convulsiones mixtas Reacción a la alarma ↓ SNC ACTIVIDAD MOTORA Actividad motora Ataxia Perdida del reflejo de enderezamiento Analgesia Anestesia perdida del reflejo corneal Perdida del reflejo pineal Parálisis de las patas anteriores Parálisis de las patas posteriores Reacción a la alarma OJOS Exoftalmia Enoftalmia Ptosis palpebral Tamaño de la pupila Nistagmus Lacrimacion OREJA Palidez Hipertermia Cianosis EFECTOS GENERALES Salivación Reacción al tacto Erección de la cola Pilo erección Micción Diarrea Priapismo Movimiento circular Temperatura rectal EFECTOS SUBJETIVOS Agresivo Pasivo Temeroso OTRAS OBSERVACIONES Muerte súbita Muerte lenta Fuente: Elaboración propia 2.5.2.5. Resultado de toxicidad oral: El extracto etanólico de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) no produjo mortalidad en las dosis administradas con una repetición durante los 14 días de evaluación de este estudio. La DL50 por vía oral de la muestra diluida en Agua destilada es mayor a 5000 mg de producto/Kg de peso corporal (> 5,0 g/ Kg de peso corporal) (Ver Tabla 9). 18 2.5.2.6. Determinación de la actividad gastroprotectora La prueba incluyó un total de seis grupos, cada uno con 5 animales. Los tratamientos y sus respectivos valores de concentración ensayados son detallados en la siguiente tabla: Tabla N° 03: Tratamientos de experimentación Grupo Animales Dosis (mg/kg pc) Control 5 - Inducidos sin 5 - tratamiento Omeprazol 5 20 Dosis 1 5 250 Dosis 2 5 500 Dosis 3 5 1000 Fuente: Elaboración propia Pc: Peso corporal La inducción para la generación del daño ulcerativo se realizó con etanol absoluto en una proporción de 1 mL/200 g. Esta inducción fue realizada por 5 días. Luego de este proceso, se iniciaron las administraciones orales de las muestras del extracto etanólico en estudio en tres dosis: 250, 500 y 1000 mg/kg peso corporal y del control positivo, Omeprazol 20mg/kg peso corporal, por Veintiún días para evaluar el efecto. Hay que tomar en cuenta que además se tienen 2 grupos más, uno control, con animales sanos, y uno denominado inducidos sin tratamiento, que son los animales a los cuales se les generó daño, pero no recibieron tratamiento con la muestra. Trascurridos los días de administración se realizó la eutanasia a todos los animales de los grupos ensayados por dislocación cervical, e inmediatamente se procedió a la necropsia de estos con la disección y extracción de los estómagos por el tercio anterior de la línea media abdominal, extrayéndose el estómago y abiertos por la curvatura mayor, lavándose cuidadosamente con cloruro de sodio 0.9 % (Suero fisiológico). Estos se extendieron sobre una tabla mediante alfileres. 19 Se evaluó la severidad de las lesiones gástricas midiendo el tamaño de las lesiones en milímetros usando un Vernier, marca Mitutoyo, y contando el número de estos en cada caso, así como la valoración de las ulceras formadas según la escala de Marhuenda. Tabla N° 04: Evaluación de lesiones (Según Marhuenda) Fuente: Marhuenda R, Bravo D. Manual de Farmacoterapia. Madrid: Elsevier 2005 (19) • Hemograma Al término del ensayo (21 días), se procedió a obtener sangre por punción cardiaca de los animales ensayados (muestras y control). La muestra de sangre fue colectada en tubos heparinizados. Se procedió luego a determinar principalmente el hematocrito, Además del conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, glóbulos blancos, formula leucocitaria, plaquetas. La determinación del hematocrito, hemoglobina y glóbulos rojos nos dan un índice de pérdida de sangre en las ulceras hemorrágicas producidas por la inducción, y además un alcance del nivel de recuperación o cicatrización de las ulceras con la administración de las muestras. 20 • Determinación del hemograma: Se realizó el hemograma (hematocrito, conteo de hematíes, glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y hemoglobina) de los animales de experimentación al final del ensayo. Tabla N° 05: Hemograma obtenido al final del tratamiento con Caléndula GRUPO DOSIS Hto Hb GR GB Pq Nivel de (mg / Kg) (%) (g/dL) (106x uL) (103x uL) (103x uL) significancia Control - 52.4 ± 2.08 14.85±0.31 7.7±0.64 7.88±2.92 1039.25±165.26 - Inducidos - 38.75±1.23 8.07±0.64 7.51±0.88 12.66±1.97 786.27±216.56 P > 0.05 s/t Omeprazol 20 65.25±1.11 18.51±0.77 9.67±0.25 11.16±1.68 1451.00±221.14 * p < 0.05 Dosis 1 250 57.53±1.04 16.53±0.61 8.76±0.09 8.18±2.69 1153.5±117.89 * p < 0.05 Dosis 2 500 58.3 ±0.85 16.65±0.76 8.69±0.42 6.2±0.81 1236.75±283.88 * p < 0.05 Dosis 3 1000 61.15±1.13 17.58±0.83 9.35±0.18 10.63±2.67 1443.00±226.28 * p < 0.05 Fuente: elaboración propia Hto =Hematocrito Hb= Hemoglobina GR=Glóbulos rojos GB= Glóbulos blancos Pq=Plaquetas * p < 0.05= Existen diferencias significativas con respecto al grupo control De acuerdo con los resultados obtenidos se observa que hay diferencias significativas en las determinaciones del hemograma completo en los valores de hematocrito, hemoglobina, glóbulos rojos, y plaquetas con respecto al grupo inducidos sin tratamiento a un nivel de significancia de p < 0.05 en las dosis de 250, 500 y 1000 mg/kg peso corporal 21 Se observó con respecto a la determinación del hemograma específicamente a las determinaciones de hematocrito, hemoglobina y glóbulos rojos, un efecto dosis dependiente, con una relación directa entre las dosis administradas (250. 500, 1000 mg/kg peso corporal) y los efectos producidos en los aumentos de los valores hematológicos en los animales. • Condiciones ambientales: Durante la duración de la prueba, los parámetros ambientales registrados en el área de experimentación son los siguientes: Temperatura (°C) 23.5 Humedad (%) 66 % Luz, Oscuridad 12L: 12O 22 2.6. MÉTODOS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Para este proyecto de tesis usaremos 3 métodos estadísticos estandarizados: • Escala de Marhuenda: Se utilizará para calificar el grado y aspecto de la mucosa de las ratas inducidas. • Prueba de Tunkey: Es un método que tendrá como fin comparar las medias individuales provenientes de un análisis de varianza de varias muestras sometidas a tratamientos distintos. • Análisis de Varianza: (ANOVA) de una vía se usa para definir si existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de tres o más grupos. 2.7. ASPECTOS ÉTICOS Este proyecto de investigación para la salud se ejecutará de acuerdo a los tres principios universales de investigación: Respeto por las personas, Beneficencia y Justicia. Así como el uso adecuado de las muestras biológicas con fines de investigación y la aplicación de metodologías que no vulneren los principios bioéticos. 23 III. RESULTADOS 3.1 De las pruebas de solubilidad Tabla N° 6: Solubilidades del extracto de Caléndula officinalis EXTRACTO SECO RESULTADOS DE LAS HOJAS DE SOLVENTES CALENDULA Alcohol 96ºC +++ Cloroformo - Extracto seco en Agua tubos de ensayo - Isopropanol + Metanol + Fuente: Elaboración propia Donde: (-) Insoluble (+) Poco soluble (++) Soluble (+++) Muy soluble En la tabla 1, se puede apreciar la solubilidad del extracto seco de las hojas de la caléndula con diferentes solventes, donde indica ser más soluble en alcohol y menos soluble en cloroformo y agua. 3.2 De la marcha fitoquímica Tabla N° 7: Marcha fitoquímica del extracto seco de las hojas de caléndula IDENTIFICACION DE METABOLITOS PRIMARIOS CONSTITUYENTES ENSAYO REACCIÓN QUÍMICOS Azucares Fehling A y B (++) Almidón Lugol (-) Cetonas 2,4 DNPH (-) Aminoácidos Ninhidrina (++) Fuente: Elaboración propia Donde: (+++) Abundante (++) Moderado (+) Leve (-) Ausencia 24 IDENTIFICACION DE METABOLITOS SECUNDARIOS CONSTITUYENTES ENSAYO REACCIÓN QUÍMICOS Rvo. Wagner Coloración marrón (++) Rvo. Dragendorff Precipitado rojo o naranja (+++) Alcaloides Rvo. Reineckato Color lila (++) Rvo. Mayer Coloración blanquecina (+) Rvo. Shinoda Color rojo intenso (+++) Compuestos Rvo. Cloruro Férrico Color verde (+) Fenólicos y Rvo. Gelatina al 1% Precipitado blanco (++) Flavonoides Rvo. De Bortranger Color rojo (+++) Aceite Rvo. Sudan III Color rojo (+) Fuente: Elaboración propia Donde: (+++) Abundante (++) Moderado (+) Leve (-) Ausencia • Toxicidad Aguda Oral El extracto etanólico de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) no produjo mortalidad en las dosis administradas con una repetición durante los 14 días de evaluación de este estudio. La DL50 por vía oral de la muestra diluida en Agua Destilada es mayor a 5000 mg de producto/Kg de peso corporal (> 5,0 g/ Kg de peso corporal) (Ver Tabla 8). Tabla Nº 8: Resultados de la Toxicidad Aguda Oral Dosis Mortalidad Machos (mg/Kg pc) Muertos/Total 2000 0/3 2000 (repetición) 0/3 Control 0/3 Fuente: Elaboración propia Pc: peso corporal 25 Tabla Nº 9: Resumen de Observaciones después de la administración de los extractos y controles PARAMETROS /RESPUESTA AGUA ALCOHOL OMEPRAZOL MP 1OOOmg/kg MP 500mg/kg MP 250mg/kg ↑SNC ACTIVIDAD MOTORA Temblores finos en el cuerpo N S N S N N Temblores fuertes en el cuerpo N N N N N N Fasciculaciones N N N N N N Convulsiones clónicas N N N N N N Convulsiones tónicas N N N N N N Convulsiones mixtas N N N N N N Reacción a la alarma S S S S N N ↓SNC ACTIVIDAD MOTORA Actividad motora N S N N N N Ataxia N S N N N N Perdida del reflejo de enderezamiento N S N N N N Analgesia N S N N N N Anestesia N S N N N N perdida del reflejo corneal N S N N N N Perdida del reflejo pineal N S N N N N Parálisis de las patas anteriores N N N N N N Parálisis de las patas posteriores N N N N N N Reacción a la alarma N N N N N N OJOS Exoftalmia N N N N N N Enoftalmia N S N N N N Ptosis palpebral N N N N N N Tamaño de la pupila N - N N N N Nistagmus N N N N N N Lacrimacion N N N N N N OREJA Palidez N S S N N N Hipertermia N S N N N N Cianosis N S N N N N EFECTOS GENERALES Salivación N S N N N N Reacción al tacto S N S S S S Erección de la cola N S S S S S Pilo erección N S S S S S Micción S S S S S S Diarrea N N N N N N Priapismo N N N N N N Movimiento circular S N S S S S Temperatura rectal - - - - - - EFECTOS SUBJETIVOS Agresivo N N S N N N Pasivo S S N S S S Temeroso S S S S S S OTRAS OBSERVACIONES Muerte súbita N N N N N N Muerte lenta - - - - -- - Fuente: Elaboración propia 26 Donde: No presenta (N) Si presenta (S) No pudo observarse (-) • Actividad Gastroprotectora El extracto etanólico de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) presenta Actividad Gastroprotectora en el modelo estudiado, a las dosis de 500 y 1000 mg de muestra/Kg peso corporal. En referencia a las mediciones realizadas al tamaño de las lesiones gástricas, a las valoraciones del daño ulcerativo y a los porcentajes de inhibición, los datos son mostrados en la Tabla 10 y Gráfico 1 Tabla N° 10: Resultados de la actividad gastroprotectora (puntaje alcanzado) SIGNOS TRATAMIENTOS Pérdida de Decoloración Edema Hemorragia N° De Intensidad TOTAL Pliegue de de la petequias de la Mucosa mucosa lesión Control 0 0 0 0 0 0 0 Inducidos sin 1 1 1 1 3 3 10 tratamiento Omeprazol 0 0 0 0 0 0 0 250 mg/Kg 1 1 1 1 3 3 10 500 mg/kg 1 1 1 1 2 1 7 1000 mg/kg 0 0 0 0 1 1 2 Fuente: Marhuenda R, Bravo D. Manual de Farmacoterapia. Madrid: Elsevier 2005 (19) La tabla de resultados expresa que la mejor actividad gastroprotectora fue presentado por el farmaco Omeprazol, la muestra al 1000 mg/Kg presento un puntaje similar al farmaco control, las otras concentraciones presentaron un puntaje muy alto indicando una baja de actividad gastroprotectora. 27 Figura 1: % Actividad Gastroprotectora en ratas inducidas tratadas con Caléndula Fuente: Elaboración propia Tabla Nº 11: Resultados de la actividad gastroprotectora (porcentaje alcanzado) TRATAMIENTOS NUMERO DE RATAS PUNTAJE % DEACTIVIDAD POR GRUPO GASTROPROTECTORA Control 5 0 100 Inducidos sin tratamiento 5 10 0 Omeprazol 5 0 100 250 mg/Kg 5 10 0 500 mg/kg 5 7 20 1000 mg/kg 5 2 80 Fuente: Marhuenda R, Bravo D. Manual de Farmacoterapia. Madrid: Elsevier 2005 (19) Los resultados de la actividad gastroprotectora demostraron que el extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis (Caléndula) a 1000 mg/kg presentó una efectividad del 80% las otras concentraciones presentaron una actividad gastroprotectora del 20% y 0% respectivamente. 28 Figura 2: Valoración de la ulceración según Marhuenda en ratas inducidas tratadas con Caléndula Fuente: Elaboración propia A mayor concentración de caléndula la ulceración es menor, las lesiones más altas serán en las ratas albinas de Holtzman inducidas sin tratamiento. Mi dosis de 1000 mg/kg no supera al Omeprazol. Contrastación de hipótesis ▪ Hipótesis especifica I Ha El extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) SI presenta metabolitos secundarios. H0 El extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) NO presenta metabolitos secundarios. Resultado: Según la tabla Nº 7 se observa que hay presencia de alcaloides en su mayoría, así como flavonoides en mayor proporción, también compuestos fenólicos, taninos y quinonas. Se concluye que hay presencia de metabolitos secundarios. Decisión: Por lo tanto, hay presencia de metabolitos secundarios. Se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna. 29 ▪ Hipótesis especifica II Ha SI existe el efecto Gastroprotector a partir del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) en ratas albinas cepas Holtzman. H0 No existe el efecto Gastroprotector a partir del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) en ratas albinas cepas Holtzman. Tabla N° 12: Análisis de varianza Fuente: Elaboración propia • Conclusión Con un nivel de confianza de 80%, aceptamos la hipótesis alterna y rechazamos la nula ANALISIS MULTIPLE POSTERIOR: PRUEBA DE TUKEY Se halla la Diferencia Honestamente Significativa (HSD) utilizando la Prueba de Tukey, HSD = 0.85, los valores mayores a este dato son los grupos que hacen la diferencia significativa (como valor absoluto), por lo tanto, son los que mostrarían mayor actividad Antiinflamatoria. 30 Tabla N° 13: PRUEBA DE TUKEY Fuente: Elaboración propia • Conclusión Con un nivel de confianza del 80%, podemos determinar que las dosis con mayor actividad es la de 1000 mg/Kg. Resultado: Al reflejar el análisis de Anova, Se determinó que todos los grupos ensayados son diferentes entre sí, seguidamente se hizo el estadístico de Tukey para saber si el valor absoluto de las diferencias de las medias de los grupos ensayados con el control positivo sin tratamiento es mayor que la diferencia honestamente significativa (HSD). Según lo explicado se concluye que todas las concentraciones ensayadas tienen efecto gastroprotector. ▪ Hipótesis especifica III Ha El extracto etanólico a partir de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) SI tienen efecto significante Gastroprotector comparado con el fármaco de omeprazol en ratas albinas cepa Holtzman. H0 El extracto etanólico a partir de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) NO tienen efecto significante Gastroprotector comparado con el fármaco de omeprazol en ratas albinas cepa Holtzman. 31 Figura 3: % de efectividad en ratas inducidas tratadas con Caléndula Fuente: Elaboración propia Resultado: Los resultados de la efectividad en ratas inducidas con el tratamiento del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (Caléndula) fue a 1000 mg/Kg 80% a 500mg/kg 20% y a 250mg/kg 0% de efectividad respectivamente. El fármaco control Omeprazol, presento un 100% de eficacia gastroprotectora. Decisión: por lo tanto, los resultados confirman que el fármaco control presenta una efectividad mayor con lo cual se rechaza la hipótesis alterna y se acepta la hipótesis nula: el extracto etanólico a partir de las hojas de Caléndula officinalis L. (Caléndula) no tiene igual efecto gastroprotector en comparación con el omeprazol. 32 IV. DISCUSIÓN 4.1 Discusión de resultados En cuanto a la primera hipótesis podemos señalar que los resultados de la marcha Fitoquímica revelaron la presencia de compuestos flavonoides, fenólicos, alcaloides. El hallazgo de estos metabolitos fue de suma importancia ya que al revisar los estudios de plantas con actividad gastroprotectora, se pudo evidenciar en los estudios de Mogrovejo (20), la presencia de flavonoides como los responsables de inducir el efecto gastroprotector, Bucciarelli (21) también menciona a los flavonoides como responsable del efecto gastroprotector y Águila (22) también menciona a los flavonoides como agente antimicótico y a las saponinas, polisacáridos, aminoácidos, y taninos como coadyuvantes del proceso, potencializando su efecto. En cuanto a la segunda hipótesis, si existe efecto gastroprotector a partir del extracto de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) en ratas albinas cepa Holtzman, se pudo evidenciar que todas las concentraciones presentan un efecto significativo en el proceso gastroprotector y que las concentraciones mayores son más efectivas en provocar este proceso. Estos estudios son comparados a los realizados por Bucciarelli (21) quien evaluó la actividad antiulcerosa del extracto etanólico de varias plantas entre ellas las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) evidenciando que la concentración de 22% fue eficaz en el modelo experimental con una inhibición del 84.4%, asimismo Mogrovejo (15) encontró que las concentraciones optimas de su especie vegetal con propiedad cicatrizante fue al 10%. Finalmente, en cuanto a la tercera hipótesis las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) elaborado a partir del extracto etanólico tiene efecto gastro protector significante en ratas albinas cepa Holtzman. Bucciarelli (21) quien analizó la Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA). Demostró que es efectiva en las lesiones gástricas en ratones provocados por un factor agresivo como el etanol. La reacción de caracterización realizada sobre el extracto obtenido sugiere la presencia de flavonoides en la planta estudiada. Estos compuestos poseen amplios efectos biológicos, entre los cuales se incluye la actividad antiulcerosa en este modelo experimental. 33 El pretratamiento con el extracto etanólico de la Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) u Omeprazol inhibió la formación de lesiones gástricas inducidas por el etanol. La gravedad de las mismas se refleja en el índice de ulcera, que fue significativamente menor en los grupos tratados en comparación con el control. Todos los estudios revisados por otros autores evidenciaron que sus productos vegetales no alcanzan la actividad gastroprotectora de los controles, esto no quiere decir que no se puedan usar, sino que pueden potencializarse con el empleo de algún excipiente durante la preparación de la formulación. 4.2 Conclusiones Los estudios realizados en el presente trabajo nos permiten llegar a las siguientes conclusiones: • El extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) presenta componentes fitoquímicos tales como flavonoides, alcaloides, compuestos fenólicos, aceite. • El extracto etanólico de las hojas de la Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) posee efecto gastroprotector en ratas con lesiones gástricas a una concentración de 1000 mg/kg. Con un efecto de 80%. • El efecto gastroprotector del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) en lesiones gástricas inducidas en ratas albinas Holtzman en comparación con el Omeprazol, se pudo evidenciar que las concentraciones ensayadas de 1000 mg/kg. (80%), 500mg/kg (20%) y 250 mg/kg. (0%) tienen un efecto gastroprotector y significante pero que a su vez no superan al Omeprazol con 100%. 34 4.3 Recomendaciones • Realizar estudios con la finalidad de dilucidar los metabolitos secundarios encontrados y determinar las estructuras químicas probable responsable de la actividad gastroprotectora. • Realizar estudios con otras partes útiles de la planta (flores, tallo, raíz) con la finalidad de demostrar posibles actividades farmacológicas. • Realizar estudios de sinergia con otras especies vegetales a fin de aumentar o potencializar la eficacia terapéutica del extracto etanólico de las hojas de Caléndula officinalis L. (Caléndula) 35 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Salaverry O, Cabrera J. Florística de algunas plantas medicinales. Rev. 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Operacionalización de las variables VARIABLES Tipo de DEFINICIÓN DEFINICIÓN DIMENSIONES INDICADORES N° DE VALOR CRITERIO variable CONCEPTUAL OPERACIONAL ITEMS FINAL S Maceración en Fitoquímica: Determinación 8 +++ Rango de VARIABLE Producto alcohol 70% por Marcha de metabolitos Abundante presencia INDEPENDIE obtenido por primarios y NTE maceración, 10 días, para la fitoquímica ++ o secundarios Extracto para la extracción de Moderado ausencia etanólico de extracción de Cualitativo y compuestos compuestos las hojas de aplicada. bioactivos, bioactivos y concentrado, Caléndula conservado y luego officinalis L almacenado en concentrado en (Caléndula) envase ámbar. Prueba de Alcohol 96°C 5 +++ Concentr Administrado en estufa a 40 °C diversas solubilidad Cloroformo Muy ación concentraciones Agua soluble final Isopropanol + Metanol Poco soluble Evidencia VARIABLE Actividad Evaluación del Crecimient de DEPENDIENT ES Cuantitativo gastroprotector extracto Evaluación de Sin lesión 3 o inhibición y transversal del Extracto etanólico de las lesiones Severidad de la Sin de Efecto etanólico de las hojas de gástricas lesión crecimient crecimien gastroprotecto r en ratas hojas de Caléndula Tamaño de o to albinas cepas Holtzman Caléndula officinalis L. lesiones officinalis L (Caléndula). (Caléndula). 39 ANEXO B. CLASIFICACION TAXONÓMICA ANEXO C. EVIDENCIAS FOTOGRÁFICAS DEL TRABAJO DE LABORATORIO ANEXO D. EVIDENCIAS FOTOGRÁFICAS DEL TRABAJO DE CAMPO 40 ANEXO 1 Recolección de la especie botánica Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) ANEXO 2 Imagen que muestra la planta de la caléndula, sus flores y hojas. 41 ANEXO 3 Altura y crecimiento de la planta de Caléndula officinalis L. (CALÉNDULA) ANEXO 4 Preparación del extracto etanólico. 42 ANEXO 5 Preparación para marcha Fitoquímica ANEXO 6 Resultado marcha Fitoquímica. 43 ANEXO 7 Pesado de los animales de experimentación ANEXO 8 Administración del etanol a los animales de experimentación 44 ANEXO 9 Disección de los animales de experimentación ANEXO 10 Corte para visualizar el estómago de los animales de experimentación inducidos a lesiones gástricas. 45 ANEXO 11 Eutanasia y disección de la rata ANEXO 12 Extracción del estómago para la apertura por la línea del tercio inferior 46 ANEXO 13 Control negativo: Grupo sin tratamiento con formación de ulceras con puntaje 3 con hemorragia y necrosis. ANEXO 14 Daño en el estómago con edema e infiltración generalizada sin tratamiento. 47 ANEXO 15 Dosis de 250mg/kg: puntaje 3 con formación de ulceras perforadas de longitud menor de 5mm y diámetro menor de 2mm ANEXO 16 Ulceras hemorrágicas menores de 2mm 48 ANEXO 17 Dosis de 500mg/kg: Puntaje 1 con formación de menos de 4 ulceras. ANEXO 18 Formación de ulceras hemorrágicas de menos de 2mm de diámetro 49 ANEXO 19 Dosis de 1000 mg/kg, Puntaje 1 con formación de una ulcera fina menor de 1mm ANEXO 20 Control positivo, con tratamiento con Omeprazol 40mg/kg y puntaje 0 50 ANEXO 21 Certificado de las ratas albinas Holtzman 51 ANEXO 22 Hoja de validación de instrumentos a 250 mg/kg 52 53 54 ANEXO 23 Hoja de validación de instrumentos al 500 mg/kg 55 56 57 ANEXO 24 Hoja de validación de instrumentos al 1000 mg/kg 58 59 60 ANEXO 25 Hoja de validación de instrumentos – Grupo experimental 61 ANEXO 26 ANEXO 27 62 ANEXO 28 63