FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA In vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS HOJAS DE Origanum vulgare L. (ORÉGANO) FRENTE A Candida albicans ATCC 10231 Y Trichophyton rubrum ATCC 28188 TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES: Bach. PEREZ PAUCAR, PEDRO DANIEL Bach. CABRERA SALAZAR, YESSENIA FLORITA ASESOR: Dr. SAMANIEGO JOAQUIN, JHONNEL WILLIAMS LIMA – PERÚ 2020 Dedicatoria Dedicado a mis padres Palmira y Manuel por ser mi guía y ejemplo de amor, dedicación y superación. Mamá gracias por sembrar en mí el valor y la fuerza que te caracteriza, Papá sin estar presente dejaste precedente de bondad y humildad. Cabrera Salazar, Yesenia Florita Quiero dedicar la siguiente investigación a toda mi familia, pero especialmente a mi madre María por haber fomentado en mí, el deseo de superación y de triunfo en la vida. Y a mi novia gracias por estar a mi lado y compartir mis logros. Perez Paucar Pedro Daniel ii Agradecimiento Gracias a Dios, a mis padres, mis hermanos y ahora a mi nueva familia. Manuel gracias por ser mi motor, motivo y razón de mis días y a ti Alain por creer en mí y ser mi compañero de vida. Cabrera Salazar Yesenia Florita Quiero agradecerle a Dios por otorgarme una familia maravillosa. A mis padres y hermanos que siempre han creído en mí, dándome ejemplos de superación, humildad y sacrificio; y por enseñarme a valorar todo lo que tengo. Perez Paucar Pedro Daniel iii ÍNDICE GENERAL RESUMEN ............................................................................................................ vi ABSTRACT ......................................................................................................... vii I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1 II. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 5 2.1. Enfoque y diseño de investigación .......................................................... 5 2.2. Población, muestra y muestreo ................................................................ 5 2.2.1. Población .......................................................................................... 5 2.2.2. Muestra .............................................................................................. 5 2.3. Variables de investigación ........................................................................ 5 2.4. Técnica e instrumento de recolección de datos ..................................... 6 2.4.1. Técnica .............................................................................................. 6 2.4.2. Instrumento ....................................................................................... 6 2.5. Proceso de recolección de datos ............................................................. 6 2.6. Métodos de análisis estadísticos ............................................................. 9 III. RESULTADOS .............................................................................................. 11 IV. DISCUSIÓN .................................................................................................... 17 4.1. Discusión ................................................................................................. 17 4.2 Conclusiones ............................................................................................ 18 4.3 Recomendaciones .................................................................................... 18 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 19 ANEXOS .............................................................................................................. 24 Anexo A. Operacionalización de la variable o variables ...................................... 24 Anexo B. Instrumentos de recolección de datos .................................................. 25 Anexo C. Evidencias de trabajo de campo .......................................................... 26 iv Índice de tablas Tabla 1. Resultados del tamizaje fitoquímico. ...................................................... 11 Tabla 2. Resultados del ensayo antimicrobiano frente a Candida albicans. ......... 12 Tabla 3. Resultados del ensayo microbiológico frente a Trichophyton rubrum. .... 13 Tabla 4. Prueba de normalidad por el test de Shapiro Wilk ................................. 14 Tabla 5. Test de Levene. ..................................................................................... 15 Tabla 6. Comparaciones múltiples por el test de Dunnett. ................................... 16 Índice de anexos Anexo A. Operacionalización de la variable o variables ...................................... 24 Anexo B. Instrumentos de recolección de datos .................................................. 25 Anexo C. Evidencias de trabajo de campo .......................................................... 26 v RESUMEN Objetivo: La presente investigación plantea el objetivo de determinar la actividad antimicótica in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) frente a Candida albicans ATCC 10231 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. Material y método: El método usado para determinar la actividad antimicótica fue Kirby-Bauer y en el caso del tamizaje fitoquímico fue mediante reacciones de coloración y precipitación. El ensayo microbiológico es de tipo experimental, cuenta con un diseño de experimento puro y es de corte transversal. El ensayo requirió del uso de 10 repeticiones y tuvo los grupos A: Aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) al 100 %; B: 50 %; C: 25 %; D: Fluconazol y E: Control. Resultados: Los resultados indican que el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) presentan compuestos fenólicos, taninos, triterpenos y esteroides. El ensayo microbiológico por el método de Kirby-Bauer evidenció que el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) al 25, 50 y 100% evidenciaron halos de inhibición de 8.86, 10.24 y 15.82 mm frente a una cepa de Candida albicans ATCC 10232 y el fármaco fluconazol presentó un halo de 28.30 mm. Frente a la cepa de Trichophyton rubrum ATCC 28188, el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) al 25, 50 y 100% evidenciaron halos de inhibición de 9.64, 10.91 y 17.93 mm y el fluconazol presentó un halo de 21.79 mm. Conclusiones: Se concluye que el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) al 25, 50 y 100% presentan efecto antimicótico frente a cepas de Trichophyton rubrum ATCC 28188 y Candida albicans ATCC 10232. Palabras clave: Origanum vulgare L.; antimicótico; aceite esencial. vi ABSTRACT Objective: The present investigation raises the objective to determine the in vitro antifungal activity of the essential oil of the leaves of Origanum vulgare L. (Oregano) against Candida albicans ATCC 10231 and Trichophyton rubrum ATCC 28188. Material and Method: The method used to determine the antifungal activity was Kirby-Bauer and in the case of phytochemical screening it was through staining and precipitation reactions. The microbiological test is experimental, has a pure experimental design and is cross-sectional. The test required the use of 10 repetitions and had the groups A: Essential oil of the leaves of Origanum vulgare L. (Oregano) at 100%; B: 50%; C: 25%; D: Fluconazole and E: Control. Results: The results were that the essential oil of the leaves of Origanum vulgare L. (Oregano) present phenolic compounds, tannins, triterpenes and steroids. The microbiological test by Kirby-Bauer method showed that the essential oil of Origanum vulgare L. (Oregano) leaves at 25, 50 and 100% showed inhibition halos of 8.86, 10.24 and 15.82 mm against a Candida albicans ATCC 10232 strain and the drug fluconazole showed a halo of 28.30 mm. In front of Trichophyton rubrum ATCC 28188 strain, the essential oil of Origanum vulgare L. (Oregano) leaves at 25, 50 and 100% showed inhibition halos of 9.64, 10.91 and 17.93 mm and fluconazole presented a halo of 21.79 mm. Conclusions: It is concluded that the essential oil of leaves from Origanum vulgare L. (Oregano) at 25, 50 and 100% present antifungal effect against strains of Trichophyton rubrum ATCC 28188 and Candida albicans ATCC 10232. Keywords: Origanum vulgare L.; antifungal; essential oil. vii I. INTRODUCCIÓN Los hongos son un amplio grupo de microorganismos que carecen de capacidad de producir sus propios nutrientes, eso los obliga a mantener una vida parasitaria, en la que muchas veces ocasionan enfermedades denominadas, micosis (1), este tipo de infección se ha incrementado durante los últimos años, siendo la especie Candida, la principal causante, ocasionando entre un 20 a 50% de los casos (2). En Estados Unidos un 50% de pacientes en UCI (Unidad de cuidados intensivos) padece de candidiasis por C. albicans, mientras que en Sudamérica solo representa entre un 1.4 a 5.2% (3), y en el Perú, se reportan de 1 a 2.6 casos por 1000 ingresos a hospitales (2). A pesar de que generalmente se reportan casos de micosis sistémica, otros estudios resaltan la importancia y gravedad de las micosis superficiales o de piel, entre ellas tenemos las micosis en los pies ocasionadas por hongos del género Trichophyton, con una prevalencia mundial del 70% y del 10% en países desarrollados (4), en Latinoamérica, esta información aún no está muy detallada pero algunos estudios evidencian que C. albicans juntos con T. rubrum, son las especies que más afectan a la población de países como Argentina (5) y Perú, pero en este último las cifras no han sido actualizadas (6), en Chile, C. albicans es la principal causante de candidiasis orofaríngea en pacientes con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) positivo, y a su vez T. rubrum, se relaciona con la dermatofitosis o tiñas, el cual atacan en mayor medida a los pacientes varones con una relación de 3 a 1 sobre pacientes femeninos (7). Otro tipo de infección micótica, es la micosis cutánea congénita, el cual ataca a un 25% de las mujeres embarazadas y es provocado principalmente por C. albicans (8). Ante el avance en la sociedad de este tipo de infección por microorganismos, se ha estado buscando otras medidas terapéuticas las cuales sean de fácil acceso a la población, una de ellas es el uso del aceite esencial de Origanum vulgare L., el cual es una planta aromatizante usada en la preparación de alimentos, pero también en la medicina tradicional para el tratamiento de problemas respiratorios, digestivos e incluso como antimicrobiano (9). El aceite esencial que presenta es el recurso más importante, debido a que contiene sustancias como carvacrol y terpineno-4-ol; en nuestro país esta especie vegetal está ampliamente distribuida, principalmente por los departamentos del sur como Arequipa, Moquegua y Tacna (10), por su amplio uso y fácil adaptación al medio, esta planta es candidata como un posible tratamiento 1 ante problemas de salud pública, como las micosis superficiales y debido a lo antes expuesto se plantea determinar la actividad antimicótica in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare l. (Orégano) frente a Candida albicans y Trichophyton rubrum. El orégano es una planta aromática originaria del continente europeo, también crece en la zona sur de nuestro país (11), su uso no es exclusivo en la preparación de alimentos, ya que se utiliza en medicina tradicional debido a sus componentes químicos como flavonoides, taninos, esteroles y terpenoides (12), los componentes en el aceite esencial son el timol, 4-terpineol, carvacrol, p-cimeno, beta- cariofileno, oxido beta – cariofileno y gamma terpineno (12), estas son las responsables de una amplia variedad de uso terapéutico como en la indigestión (13); antioxidante, carminativo, expectorante, estimulante (14) y contra diversas infecciones por bacterias, virus y hongos (15). En este último efecto terapéutico, para tratar infecciones por Candida albicans, el cual es un microorganismo que cuenta con capacidad de resistir el efecto de diversos medicamentos ocasionando una serie de enfermedades sistémicas y superficiales; es agente etiológico de la candidiasis, enfermedad intrahospitalaria (16), ocasionada por el uso de catéteres intravenosos (17). El tratamiento en esta infección nosocomial se encuentran el fluconazol (18). Otra especie de hongo que está constituyendo un problema de salud pública es Trichophyton rubrum, agente etiológico de la dermatofitosis crónica, enfermedad el cual se trata con medicamentos antimicóticos que cada año aumenta la resistencia disminuyendo la efectividad y asimismo un incremento de la toxicidad en los pacientes que los utilizan (19). Villavicencio J, et al. (2016) quien obtuvo el aceite esencial de dicha especie vegetal por arrastre de vapor y evaluó su efecto antimicótico in vitro ante C. albicans, obteniendo resultados favorables (20); estos resultados son similares a los obtenidos por Alca (2018) quien utilizo el aceite esencial de O. vulgare L., contra cepas de C. albicans y también en asociación con el aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum (canela), obteniendo óptimos efectos antimicóticos en ambas pruebas (21), por otro lado Cuzco y Chico (2015) quienes luego de someter el aceite esencial de O. vulgare L. contra cepas de Rhizoctonia solani, se inhibió el crecimiento de este en un 97% al cuarto día de estudio (22), otros estudios como el de Baj, et al. (2020) quienes evidencian el efecto antimicótico del aceite esencial 2 de Origanum vulgare L, ante cepas bucales de Candida spp atribuyéndole la actividad a sus componentes químicos como carvacrol 1,8 cineol, alfa pineno y monoterpenos fenólicos (23), al igual que Florin, et al. (2016) quienes identificaron a través de cromatografía de gases, algunas sustancias como el transcariofileno y sabineno, luego de obtener la actividad antimicótica del aceite esencial a una dosis de 0.5 mg/L (24), por último Tapiero et al. (2019) luego de obtener el aceite esencial por la técnica de hidrodestilación asistida por microondas, identificaron por cromatografía de gases, algunos agentes volátiles como p-cimeno, terpinen-4-ol, carvacrol y timol (25). Este estudio tiene la finalidad practica de aportar de manera científica en el área de la fitomedicina, debido a que presenta al aceite esencial de Origanum vulgare L como una alternativa atractiva en el tratamiento contra infecciones emergentes como las micosis, además reforzara el conocimiento sobre los diversos constituyentes químicos que se encuentran presentes en estas sustancias, el cual sirve de modelo para la formulación de una nueva familia de medicamentos. Asimismo, se realizará un aporte a la comunidad ofreciendo información científica sobre las bondades del aceite esencial, el cual significa una alternativa económica y de fácil acceso para la población que no cuenta con los suficientes recursos económicos para acceder a un determinado tratamiento médico; por otro lado para lograr a los objetivos del estudio se acude al empleo de técnicas de investigación, uso de instrumentos validados y su procesamiento en un software. El objetivo general de este estudio es determinar la actividad antimicótica in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) frente a Candida albicans ATCC 10231 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. Los objetivos específicos son: Determinar los tipos de metabolitos secundarios presentes en el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano). Evaluar la actividad antimicótica del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) al 25 %, 50 % y 100 % sobre cepas de Candida albicans ATCC 10231 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. 3 Comparar la actividad antimicótica del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) frente a discos de fluconazol sobre cepas de Candida albicans ATCC 10231 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. Como hipótesis general del estudio se plantea que el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) presenta actividad antimicótica in vitro significativamente favorable frente a Candida albicans ATCC 10231 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. 4 II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Enfoque y diseño de investigación La presente investigación es de enfoque cuantitativo. Diseño experimental, ya que la investigación planteada pretende manipular de manera intencional a las variables independiente, aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, con la variable dependiente (actividad antimicótica in vitro) para evidenciar la relación tipo causa- efecto (26). Además, este estudio es analítico, ya que se trabajará con más de una variable. Esta investigación presenta un nivel aplicativo de corte transversal, ya que se pretende dar una solución directa a un problema específico al evaluar el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare como antimicótico (27). 2.2. Población, muestra y muestreo 2.2.1. Población ▪ 25 arbustos de Origanum vulgare (Orégano) colectada en la provincia de Jorge Basadre en la región Tacna. ▪ Cepas fúngicas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188 2.2.2. Muestra ▪ 5000 g de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) colectada en la provincia de Jorge Basadre en la región Tacna ▪ 1 Kwik stik de las cepas fúngicas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188 2.3. Variables de investigación Independiente: Concentración del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) Dependiente: Efecto antimicótico in vitro. 5 2.3.1 Definición conceptual Independiente: Es el líquido oleoso e insoluble extraído de las hojas de la especie vegetal Origanum vulgare. Dependiente: Es la capacidad de una sustancia para inhibir el crecimiento o eliminar a un hongo. 2.3.2 Definición operacional Independiente: Se realizará una destilación por arrastre de vapor de las hojas de la especie vegetal Origanum vulgare. Dependiente: Se inocularán placas petri con las cepas fúngicas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188 y se expondrán las sustancias experimentales. 2.4. Técnica e instrumento de recolección de datos 2.4.1. Técnica La técnica de estudio metodológico consiste en la observación y la aplicación de técnicas y procedimientos analíticos como la destilación por arrastre de vapor con agua, tamizaje fitoquímico y el método de difusión en agar denominado Kirby-Bauer. 2.4.2. Instrumento El instrumento consiste en una ficha de observación ad hoc para registrar el análisis microbiológico del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano). 2.5. Proceso de recolección de datos 2.5.1. Autorización y coordinaciones previas para la recolección de datos Para la ejecución del presente estudio se solicitó una carta de presentación correspondiente a la Universidad María Auxiliadora, con el que se gestionó los permisos para los ensayos mencionados. 6 2.5.2. Aplicación de instrumento(s) de recolección de datos Recolección y clasificación taxonómica: La especie botánica Origanum vulgare (Orégano) fue colectada en un lugar con las coordenadas 17°18’54’’S 70°26’21’’O ubicado en la comunidad campesina de Borogueña, distrito de Ilabaya, provincia de Jorge Basadre en la región Tacna. Esta planta se colectó en horas de la mañana con ausencia total de lluvia y con ayuda de una tijera de acero inoxidable. La planta se limpió y guardó en un recipiente de material adsorbente y agujereado para ser transportado a Lima. El espécimen botánico colectado se identificó y clasificó taxonómicamente en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Tratamiento postcosecha y extracción: Las hojas se seleccionaron para eliminar aquellas que presenten signos de descomposición o se encuentren incompletas. Las hojas seleccionadas se limpiaron y se procedió a pesar. Arrastre de vapor con agua: Luego las hojas se llevaron a un balón de vidrio con agua para la posterior ejecución de una destilación por arrastre de vapor por 6 horas (29). Después, los líquidos inmiscibles condensados resultantes en el matraz recolector se separaron por decantación. El líquido amarillento acumulado en la superficie se desecó con sulfato de sodio anhidro y luego se almacenó en refrigeración para su posterior uso. Tamizaje fitoquímico: Se ejecutaron reacciones de coloración y precipitación con el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L (Orégano) según los métodos descritos por Lock (30). Se preparó 10 ml de una solución del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L (Orégano) y se vertió 0.5 ml en 15 tubos diferentes. 7 Ensayo antimicótico Preparación del estándar 0.5 de McFarland: Se elaboró una solución de cloruro de bario 0.048 M y para ello, se pesó 0.499 g de cloruro de bario y posteriormente se disolvió con agua destilada en un matraz aforado de 50 ml. Se elaboró una solución de ácido sulfúrico 0.18 M y para ello, se disolvió 1.01 ml de ácido sulfúrico concentrado en un matraz aforado de 100 ml. El estándar 0.5 de McFarland se obtuvo disolviendo 0.5 ml de la solución de cloruro de bario 0.048 M con 95.5 ml de ácido sulfúrico 0.18M. Preparación del inóculo: Se pesó 2.4 g de caldo deshidratado de papa dextrosa para luego ser disuelto con 100 ml de agua destilada. La solución resultante contenida en un frasco de vidrio transparente se esterilizó en una autoclave a 121°C durante 15 min. (Indicación del fabricante). El caldo esterilizado se vertió a un tubo de ensayo después de enfriarse. Las cepas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188 se reconstituyeron e incubaron en agar sabouraud y luego de 72 horas se tomó una colonia con un asa de siembra (asa de kohle) calibrada de 10 µl para ser vertida sobre el caldo de papa dextrosa preparado y se homogenizó el mismo con el asa de siembra. La cepa suspendida en el caldo se incubó a 30°C por 48 horas. El caldo resultante presentó una turbidez (evidencia del crecimiento del hongo) después de las 48 horas de incubación. La turbidez del mismo se ajustó a la turbidez con solución salina (NaCl 0.9 %) del estándar previamente preparado (0.5 McFarland), por comparación visual, se observaron los tubos delante de un fondo blanco con líneas negras para un mejor contraste. Con el objetivo de que la suspensión preparada presente cerca de 1 a 2 x 108 UFC/ml de la cepa Candida albicans ATCC 10231 y Trichophyton rubrum ATCC 28188 (31). Inoculación de las Placas: Se disolvió 32.5 g de agar dextrosa sabouraud en 500 ml de agua destilada. La solución resultante contenida en un frasco de vidrio transparente se esterilizó en la 8 autoclave a 121° C durante 15 min. (Indicación del fabricante). Después de este proceso, la solución resultante se vertió aproximadamente 25 ml en 10 placas petri estériles de 90 x 15 mm para luego dejarlas en reposo hasta lograr que gelifiquen, para cada hongo. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inóculo, se procedió a sumergir un asa de siembra calibrada de 10 µl para inocular a las 10 placas con agar dextrosa sabouraud, estriando con el asa de siembra en tres direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo. Preparación de los discos: Los discos que se usaron para este ensayo fueron con papel filtro whatman N° 1 de 9 mm de diámetro esterilizados. Se prepararon 3 grupos: grupos experimentales 1; 2 y 3 además de fluconazol (50 µg). Los grupos experimentales se prepararon de la siguiente manera El grupo experimental 1: 250 µl de aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L (Orégano) + 750 µl de dimetilsulfóxido El grupo experimental 2: 500 µl de aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L (Orégano) + 500 µl de dimetilsulfóxido El grupo experimental 3: 1000 µl de aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L (Orégano). Los discos se embebieron con los aceites esenciales a diferentes concentraciones para luego ser puestos sobre la superficie de las placas previamente inoculadas con cada una de las cepas (31). 2.6. Métodos de análisis estadísticos Los datos recolectados se ordenaron y posteriormente registrados en el software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) en su versión 25 para su procesamiento. Se usó de estadística descriptiva para determinar elementos de tendencia central y dispersión. Además, se usó estadística inferencial para la contrastación de la hipótesis propuesta en la presente investigación. Para evidenciar la diferencia entre las medias de los halos de 9 inhibición de los diferentes grupos del ensayo antimicótico se usó ANOVA y posteriormente se usó de la prueba de Tukey para realizar múltiples comparaciones y evaluar si los grupos experimentales tienen mayor halo de inhibición estadísticamente significativa. 2.7 Aspectos éticos Se tomó en cuenta las normas y metodologías sobre la manipulación, transporte, utilización, descontaminación y eliminación de desechos por ser un estudio de carácter microbiológico. 10 III. RESULTADOS 3.1. Tamizaje fitoquímico En la siguiente tabla se muestra con detalle los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano). Tabla 1. Resultados del tamizaje fitoquímico. N° Ensayo Metabolito Resultado 1 Borntrager Quinonas - 2 FeCl3 Compuestos fenólicos + 3 Shinoda Flavonoides - 4 NaOH 10% Antocianinas - 5 Gelatina Taninos ++ 6 Gelatina Sal Taninos ++ 7 Wagner Alcaloides - 8 Mayer Alcaloides - 9 Liebermann Burchard Triterpenos y Esteroides + 10 Baljet Lactonas α,β-insaturadas - 11 Benedict Azucares Reductores - 12 Fehling Azucares Reductores - 13 Espuma Saponinas - Negativo (-), Positivo (+), Moderado (++), Abundante (+++) Fuente: Elaboración propia, 2020 11 La tabla anterior muestra que el tamizaje fitoquímico del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) presenta compuestos fenólicos, taninos y triterpenos-esteroides. 3.2. Ensayo microbiológico La siguiente tabla muestra a detalle los resultados del ensayo microbiológico para determinar el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) frente a una cepa de Candida albicans ATCC 10232. Tabla 2. Resultados del ensayo antimicrobiano frente a Candida albicans. Frente a Candida albicans ATCC 10232 Orden Control Fluconazol Aceite Aceite Aceite esencial 25 esencial 50 esencial % % 100 % 1 6 28,43 8,88 10,17 15,79 2 6 28,23 8,62 10,13 15,53 3 6 28,24 8,70 10,16 15,73 4 6 28,48 8.89 10,36 15,93 5 6 28,32 9.16 10,34 15,90 6 6 28,40 9.46 10,27 15,74 7 6 28,20 8.99 10,20 15,95 8 6 28,34 8.89 10,44 15,99 9 6 28,09 8,22 10,12 15,87 10 6 28,28 8,78 10,18 15,75 Media 6 28,30 8,86 10,24 15,82 12 La tabla anterior muestra que, según el ensayo microbiológico, el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25, 50 y 100% evidenciaron halos de inhibición de 8.86, 10.24 y 15.82 mm frente a una cepa de Candida albicans ATCC 10232. Pero el fármaco fluconazol presentó un halo de 28.30 mm. La siguiente tabla muestra a detalle los resultados del ensayo microbiológico para determinar el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) frente a una cepa de Trichophyton rubrum ATCC 28188. Tabla 3. Resultados del ensayo microbiológico frente a Trichophyton rubrum. Frente a Trichophyton rubrum ATCC 28188 Orden Control Fluconazol Aceite Aceite Aceite esencial 25 esencial 50 esencial % % 100 % 1 6 21,78 9,44 10,85 17,90 2 6 21,68 9,40 10,81 17,84 3 6 21,77 9,75 10,95 17,96 4 6 21,75 9,68 10,91 17,92 5 6 21,73 9,38 10,78 17,83 6 6 21,70 9,31 10,75 17,82 7 6 21,90 9,88 11,02 18,01 8 6 21,93 9,92 11,04 18,03 9 6 21,69 9,65 10,89 17,92 10 6 21,96 9,98 11,11 18,10 Media 6 21,79 9,64 10,91 17,93 13 La tabla anterior muestra que, según el ensayo microbiológico, el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25, 50 y 100% evidenciaron halos de inhibición de 9.64, 10.91 y 17.93 mm frente a una cepa de Trichophyton rubrum ATCC 28188. Pero el fármaco fluconazol presentó un halo de 21.79 mm. Para determinar el estadístico necesario para alcanzar el objetivo planteado en esta investigación es necesario determinar si existe distribución normal en los resultados del ensayo microbiológico y en la siguiente tabla se muestra el test de Shapiro Wilk, para tal fin. Tabla 4. Prueba de normalidad por el test de Shapiro Wilk Pruebas de normalidada,c Shapiro-Wilk Grupos Estadístico gl Sig. Halos de inhibición frente a Candida albicans Fluconazol ,984 10 ,983 Aceite 25% ,962 10 ,808 Aceite 50% ,893 10 ,185 Aceite 100% ,928 10 ,433 Halos de inhibición frente a Trichophyton rubrum Fluconazol ,868 10 ,095 Aceite 25% ,919 10 ,350 Aceite 50% ,965 10 ,839 Aceite 100% ,943 10 ,592 *. Esto es un límite inferior de la significación verdadera. a. Halos de inhibición es constante cuando Grupos = Control. Se ha omitido. b. Corrección de significación de Lilliefors c. Halos de inhibición2 es constante cuando Grupos = Control. Se ha omitido. La tabla anterior muestra que según el test de Shapiro Wilk los valores de significancia asintótica bilateral es mayor al 0.05. Por esto, se puede concluir si existe distribución normal en los resultados del ensayo microbiológico para determinar el efecto antimicótico del aceite esencial de las hojas de Origanum 14 vulgare (Orégano) frente a cepas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. Para determinar el estadístico necesario para alcanzar el objetivo planteado en esta investigación es necesario determinar si existe homogeneidad de varianzas en los resultados del ensayo microbiológico. En la siguiente tabla se muestra el test de Levene. Tabla 5. Test de Levene. Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico de Levene df1 df2 Sig. Halos de inhibición frente a 4,903 4 45 ,002 Candida albicans Halos de inhibición frente a Trichophyton 12,013 4 45 ,000 rubrum df: degrees of freedom (grados de libertad) La tabla anterior muestra que según el test de Levene la significancia asintótica bilateral es menor al 0.05. Por esto, se puede deducir que no existe homogeneidad de varianzas en los resultados del ensayo microbiológico para determinar el efecto antimicótico del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) frente a cepas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. La prueba estadística elegida para alcanzar el objetivo planteado en esta investigación fue el estadístico paramétrico T3 de Dunnett para hacer comparaciones múltiples entre el grupo control con los grupos experimentales. La siguiente tabla muestra a detalle el test de Dunnett. 15 Tabla 6. Comparaciones múltiples por el test de Dunnett. 95% de intervalo Diferencia de confianza de medias Error Límite Límite (I) Grupos (J) Grupos (I-J) estándar Sig. inferior superior Halos de Control Fluconazol - - -22,30100* ,03716 ,000 inhibición 22,4330 22,1690 frente a Aceite -2,85900* ,10372 ,000 -3,2274 -2,4906 Candida 25% albicans Aceite -4,23700* ,03467 ,000 -4,3602 -4,1138 50% Aceite -9,81800* ,04361 ,000 -9,9729 -9,6631 100% Fluconazol Control 22,30100* ,03716 ,000 22,1690 22,4330 Aceite 19,44200* ,11018 ,000 19,0692 19,8148 25% Aceite 18,06400* ,05083 ,000 17,9037 18,2243 50% Aceite 12,48300* ,05730 ,000 12,3019 12,6641 100% Halos de Control Fluconazol - - -15,78900* ,03274 ,000 inhibición 15,9053 15,6727 frente a Aceite -3,63900* ,07742 ,000 -3,9140 -3,3640 Trichophyton 25% rubrum Aceite -4,91100* ,03758 ,000 -5,0445 -4,7775 50% Aceite - - -11,93300* ,02933 ,000 100% 12,0372 11,8288 Fluconazol Control 15,78900* ,03274 ,000 15,6727 15,9053 Aceite 12,15000* ,08406 ,000 11,8693 12,4307 25% Aceite 10,87800* ,04984 ,000 10,7206 11,0354 50% Aceite 3,85600* ,04396 ,000 3,7173 3,9947 100% La tabla anterior muestra que según el test de Dunnett el valor de significancia asintótica menor al 0.05. Por esto, se puede concluir que existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25,50 y 100% frente a cepas de Candida albicans ATCC 10232 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. 16 IV. DISCUSIÓN 4.1. Discusión En la presente investigación se evidenció que, mediante reacciones de coloración y precipitación, el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) presenta compuestos fenólicos, taninos y triterpenos-esteroides. De la misma manera, Venkateswara et al (2011) aislaron e identificaron dos triterpenos y un esteroide mediante técnicas cromatográficas y espectroscópicas a partir del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de la India. (32) En este mismo sentido, Bokov et al (2020) evidenciaron la presencia de taninos y compuestos fenólico en el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare mediante técnicas de coloración sobre un cromatofolio con silicagel. (33) Además, Van-Der-Mheen et al (2010) identificó algunos compuestos terpénicos y algunos otros fenólicos en el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de Holanda, mediante técnicas espectroscópicas. (34) Las investigaciones anteriormente citadas apoyan los resultados de la presente investigación, aunque todas las muestras sean de diferente origen. Esto, puede sugerir que estos tipos de compuestos son tipos de metabolitos característicos de la especie. El aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25, 50 y 100% evidenciaron halos de inhibición de 8.86, 10.24 y 15.82 mm frente a una cepa de Trichophyton rubrum ATCC 28188. Pero, fluconazol presentó un halo de 21.79 mm. De la misma manera, Assiri et al (2016) publicaron en una investigación que el aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de Arabia Saudita, tiene efecto antimicótico in vitro con un halo de inhibición de 38 mm y una concentración mínima fungicida de 40 µg/ml frente a Trichophyton rubrum mediante las técnicas de disco de difusión en agar y micro dilución en caldo, respectivamente. (35) También, Lachos y Laurente (2018) evidenciaron el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de Otuzco-La Libertad, frente a una cepa de Trichophyton rubrum con una concentración mínima inhibitoria de 0.125 % y una concentración mínima fungicida de 0.25 mediante la técnica de macro dilución en caldo. (36) El aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25, 50 y 100% evidenciaron halos de inhibición de 8.86, 10.24 y 15.82 mm frente a una cepa de Candida albicans ATCC 10232. Pero el fármaco fluconazol presentó un halo de 17 28.30 mm. En este mismo sentido, Sharifzadeh et al (2016) evidenciaron el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de Irán, frente a Candida albicans sin y con resistencia al fármaco fluconazol con una concentración mínima inhibitoria de 300 µg/ml y una concentración mínima fungicida de 400 µg/ml frente a Candida albicans resistente a fluconazol mediante el método de micro dilución en caldo. (37) También, Manohar et al (2001) en una investigación mostró el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de Estados Unidos, frente a Candida albicans con una concentración mínima inhibitoria de 0.125 mg/ml y una concentración mínima fungicida de 0.25 mg/ml mediante micro dilución en caldo. (38) De la misma manera, Tampieri et al (2005) evidenciaron el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare, proveniente de Italia, con una concentración mínima inhibitoria de 500 µg/ml y una concentración mínima fungicida de 500 µg/ml mediante el método de micro dilución en caldo. (38) 4.2 Conclusiones El aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) presenta compuestos fenólicos, taninos y triterpenos-esteroides. El aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25, 50 y 100% presenta efecto antimicótico frente a una cepa de Trichophyton rubrum ATCC 28188 y otra de Candida albicans ATCC 10232. El aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) al 25, 50 y 100% no presenta mayor efecto antimicótico que fluconazol frente a una cepa de Trichophyton rubrum ATCC 28188 y otra de Candida albicans ATCC 10232. 4.3 Recomendaciones Realizar investigaciones para determinar el efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano) de diferentes orígenes. Realizar investigaciones de aislamiento biodirigido con los ensayos microbiológicos para encontrar compuestos con efecto antimicótico Realizar investigaciones para determinar el efecto antimicótico in vivo del aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare (Orégano). 18 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Fernandez Conejo A, et al. Documento de consenso SEIP-AEPap-SEPEAP sobre la etiología, el diagnóstico y el tratamiento de las infecciones cutáneas micóticas de manejo ambulatorio. Pediatr Aten Primaria. 2016;18(72):e149– 72. 2. Zurita S. 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Operacionalización de la variable o variables Variable Definición Definición Dimensiones Indicadores Escala Valor conceptual operacional Aceite Es el líquido Se realizará Metabolitos Quinonas Ausencia esencial de oleoso e una secundarios Compuestos Leve las hojas de insoluble destilación fenólicos Moderado Origanum extraído de por arrastre Terpenos Medio vulgare las hojas de de vapor de Alcaloides Abundante (Orégano) la especie las hojas de Lactonas vegetal la especie α,β- Origanum vegetal insaturadas vulgare Origanum Taninos Razón vulgare Antocianinas Flavonoides Control Saponinas negativo, fluconazol y aceite Discos de esencial al difusión 25, 50 y 100 Tratamiento % Efecto Es la Se Inhibición del Halo de Razón 0: nulo antimicótico capacidad de inocularán crecimiento o inhibición 8 – 14 mm: una placas petri eliminación del (mm) Sensibilida sustancia con las cepas hongo d límite para inhibir el fúngicas de 14 – 20 crecimiento o Candida mm: Medio eliminar a un albicans <20 mm: hongo ATCC 10232 Muy y sensible Trichophyton rubrum ATCC 28188 y se expondrán las sustancias experimental es 24 Anexo B. Instrumentos de recolección de datos ENSAYO MICROBIOLÓGICO IN VITRO Investigador (es): Perez Paucar, Pedro Daniel Cabrera Salazar, Yesenia Florita Muestra: Aceite esencial de las hojas de Origanum vulgare L. (Orégano) Fecha: Frente a Candida albicans ATCC 10232 Aceite Control Fluconazol Aceite esencial Aceite esencial 100 Dimetilsulfóxido 50 µg 25 % esencial 50 % % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Frente a Trichophyton rubrum ATCC 28188 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fuente: Elaboración propia Observaciones:………………………………………………………………………. 25 Anexo C. Evidencias de trabajo de campo Tratamiento y extracción de aceite esencial Ensayo Fitoquímico 26 27 Ensayo microbiológico 28