FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EFECTO HIPOGLUCEMIANTE DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DEL FRUTO DE Cyclanthera pedata CULTIVAR SERRANA EN Rattus norvergicus Holtzman TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES: Bach. RODRÍGUEZ FAVILLANO, LUZ MARÍA Bach. YUPANQUI FLORES, SADIT RAYDA ASESOR: Mg. CORDOVA SERRANO, GERSON LIMA – PERÚ 2020 1 DEDICATORIA A Margarita y Vicente mis amados padres, gratitud infinita por su abnegado e incondicional apoyo. A Luis, mi esposo, compañero y autor intelectual de este logro; gracias eternas por asumir roles en mis ausencias. A mis hijos, que cuando hurguen en los recuerdos de su madre encuentren en estas letras un importante motivo para superarse en la vida. (LUZ.R) A Dios por brindarme salud y fortaleza para lograr mis objetivos. A mis padres Juan y Clotilde por estar siempre presente con su apoyo incondicional en los momentos más difíciles y ser parte de este logro. A mi hija ANGELA GABRIELA por ser mi motor y motivo sobre todo principal inspiración para lograr este propósito. (SADIT.Y) 2 AGRADECIMIENTO A Nuestro Padre Celestial por sus permanentes bendiciones, sin ellas nuestra vida no tendría sentido, que la energía indescriptible de su amor permita que el amor al prójimo se imponga por sobre toda adversidad en estos tiempos de pandemia A nuestros admirables padres por conducirnos por sendas de rectitud, superación y la práctica de valores como ejes fundamentales en el tránsito por esta vida, los mismos que ha sido fundamentales para sortear dificultades y obtener aciertos que nos han permitido cumplir con nuestra ansiada meta. A la Universidad María Auxiliadora, por la oportunidad brindada para continuar con nuestra formación profesional. A los Docentes que sin egoísmo compartieron sus conocimientos en post de una formación óptima para asumir retos como profesionales competentes. Eterna gratitud, a todas las personas que nos ofrecieron una mano sin esperar retribución alguna. 3 INDICE I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 10 II. MATERIALES Y METODOS............................................................................................ 14 2.1. Enfoque y diseño de la investigación. ................................................................. 14 2.2. Población, muestra y muestreo ............................................................................ 14 2.2.1. Población ........................................................................................................... 14 2.2.2. Muestra: ............................................................................................................. 14 2.2.3. Criterio de exclusión ....................................................................................... 14 2.2.4. Criterio de inclusión. ....................................................................................... 15 2.3. Variables de investigación. .................................................................................... 15 2.3.1. Definición conceptual: .................................................................................... 15 2.3.2. Definición operacional: ................................................................................... 15 2.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos (Validación de los instrumentos de recolección de datos). ......................................................................... 15 2.5. Plan de recolección de datos ................................................................................ 16 2.5.1. Recolección y selección de muestra............................................................ 16 2.5.2. Preparación del extracto hidroalcohólico de la Cyclanthera pedata. .... 16 2.5.3. Ensayo Fotoquímico........................................................................................ 16 2.5.4. Adquisición de Animales de experimentación. .......................................... 17 2.5.5. El protocolo de ensayo del tratamiento. ...................................................... 17 2.5.5.1. Inducción a la hiperglucemia en animales de experimentación. .... 18 2.5.5.2. Administración de tratamientos. ........................................................... 18 2.6. Métodos de análisis estadístico. .......................................................................... 18 2.7. Aspectos éticos: ...................................................................................................... 18 III. RESULTADOS .............................................................................................................. 20 3.1. Ensayo Fitoquímico Preliminar ............................................................................. 20 3.2. Evaluación de la actividad hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de cyclanthera pedata en ratas hiperglucémicas inducidas con ALOXANO ................ 21 3.2.1. Análisis ANOVA de las Glicemias Basales de los grupos experimentales................................................................................................................. 23 3.2.2. Análisis de Varianza (ANOVA) del nivel de glicemia de rattus norvergicus Holtzman luego de la inducción con Aloxano y durante los tratamientos de los grupos experimentales. ............................................................. 24 IV. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 31 4 4.1 Discusión de resultados ......................................................................................... 31 4.2 Conclusiones ............................................................................................................ 34 4.3 Recomendaciones ................................................................................................... 34 V. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................. 36 VI. ANEXOS ........................................................................................................................ 38 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Grupos experimentales para evaluar el efecto hipoglucemiante de extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera pedata .................................................................... 17 Tabla 2: Ensayo Fitoquímico preliminar del extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera pedata ................................................................................................................... 20 Tabla 3: Registro de dosis y frecuencia de tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto Cyclanthera pedata .......................................................................................................... 21 Tabla 4:: Análisis de varianza (ANOVA) del promedio de glicemias basales de las ratas normo glicémicas de los grupos experimentales ................................................................... 23 Tabla 5: Sub conjunto homogéneo (HSD de Tukey) del promedio de glicemia basales de ratas normo glicémicas ............................................................................................................. 24 Tabla 6: Análisis de varianza ANOVA del promedio de glicemia de las ratas hiperglicemicas inducidas con aloxano y tratadas con extracto hidroalcoholico de cyclanthera pedata .................................................................................................................... 24 Tabla 7: Tés paramétricos de Kruskal Wallis de la distribución de los niveles de glicemia luego de la inducción y durante los tratamientos con el extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata ................................................................................................................... 26 Tabla 8: Sub conjuntos homogéneos (PRUEBA DE AMES-HOWELL) de los .................... 27 Tabla 9: Sub conjuntos homogenicos (PRUEBA DE AMES-HOWELL) de los promedios de niveles de glicemia de ratas hiperglucémicas luego de 24 horas de tratamiento. .............. 28 Tabla 10: Sub conjunto homogéneo (PRUEBA DE AMES-HOWELL) de los niveles de glicemia de ratas hiperglucémicas luego de 48 horas de tratamiento. ................................ 29 Tabla 11: Sub conjunto homogéneo (PRUEBA DE AMES-HOWELL) de los promedios de niveles de glicemia de ratas hiperglucemicas luego de las 72 horas de tratamiento ......... 29 Tabla 12: Sub conjunto homogéneo (PRUEBA DE AMES-HOWELL) de promedio de glicemia de ratas hiperglucemicas luego de 96 horas de tratamiento ................................. 29 Tabla 13: Operacionalización de variables ............................................................................. 38 Tabla 14: Instrumento de recolección de datos. .................................................................... 40 5 Tabla 15: Prueba de Kolmogorov-Smirnov ............................................................................. 41 Tabla 16: prueba de homogeneidad........................................................................................ 42 Tabla 17: Pruebas Post-Hoc .................................................................................................... 43 INDICE DE FIGURAS Figura 1: Tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera pedata de ratas hiperglucémicas inducidas con Aloxano ........................................................................ 22 Figura 2:: Resumen de prueba de hipótesis tés paramétrico de Kruskal Wallis de la distribución de los niveles de glicemia luego de la inducción y durante los tratamientos con el extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata ................................................................ 26 Figura 3: Estimación en años de números de adultos con diabetes .................................... 39 Figura 4: Filtración del extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera Pedata .............. 46 Figura 5: Preparación del fruto de Cyclanthera Pedata......................................................... 46 Figura 7: Tamizaje Fitoquímico del extracto Hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera Pedata ........................................................................................................................................ 46 Figura 6: Extracto Hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera Pedata .................................... 46 Figura 8:Inducción a la Glicemia ............................................................................................. 46 Figura 9: Administración de tratamientos ............................................................................... 46 6 RESUMEN La diabetes es una fuente de riesgo para adquirir enfermedades visuales, cerebrales, nefropatías y cardiovasculares que se presenta con mayor frecuencia hoy en día en nuestra población objetivo: evaluar el efecto hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata Cultivar Serrana en Rattus norvergicus Holtzman. y la presencia de metabolitos secundarios de dicho extracto metodología: Se evaluó la presencia de metabolitos secundarios mediante un precipitado y cambio de color según el análisis cuantitativo con diferentes reactivos, para obtener el efecto hipoglucemiante, se formaron 5 grupos de 5 ratas, que fueron divididas aleatoriamente de la siguiente manera: Grupo Blanco (suero fisiológico), Grupo C. Negativo (aloxano), Grupo C. Positivo Glibenclamida Grupo experimental 1 (Extracto de Cyclanthera pedata 750mg), Grupo experimental 2 (extracto de Cyclanthera pedata 1000mg/kg/día). Los animales se alojaron en jaulas metálicas y se mantuvieron en dieta rica en azúcares durante 48 horas antes de comenzar el experimento luego se preparó una suspensión con aloxano (agente inductor a hiperglicemia) puro en cloruro de sodio a una concentración de 130 mg/ml. Se les administro diariamente a las ratas, una dosis de acuerdo con su peso (mg/kg de peso), vía oral, con jeringa de 1 ml sin cánula. Los animales experimentales fueron separados por grupos en condiciones adecuadas y se les alimento de acuerdo con el protocolo de investigación. resultados: En el tamizaje fitoquímico preliminar del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata se identificó la presencia de metabolitos secundarios, encontrándose a los esteroles y triterpenos en mayor cantidad seguidos de composición fenólica y catequinas en regular cantidad, en el efecto hipoglucemiante se demostró Luego de una serie de pruebas realizadas a las ratas, se determinó que en el tratamiento administrado de 96 horas el extracto hidroalcohólico del fruto de la Cyclanthera Pedata dio su efecto hipoglucemiante a una concentración de 1000mg conclusión: el Extracto del fruto de Cyclanthera pedata presentó una diferencia significativa entre la glibenclamida de 5mg en Rattus norvergicus Holtzman . Palabras claves: Cyclanthera pedata., análisis fitoquímico, efecto hipoglucemiante, diabetes. 7 Abstrac Diabetes is a source of risk for acquiring visual, brain, nephropathy and cardiovascular diseases that occurs more frequently today in our target population: to evaluate the hypoglycemic effect of the hydroalcoholic extract of the Cyclanthera pedata Cultivar Serrana in Rattus norvergicus Holtzman. and the presence of secondary metabolites of said extract. Methodology: The presence of secondary metabolites was evaluated by means of a precipitate and color change according to the quantitative analysis with different reagents, to obtain the hypoglycemic effect, 5 groups of 5 rats were formed, which were randomly divided as follows: White Group ( physiological serum), Group C. Negative (alloxane), Group C. Positive Glibenclamide Experimental group 1 (extract of Cyclanthera pedata 750mg), Experimental group 2 (extract of Cyclanthera pedata 1000mg / kg / day). The animals were housed in metal cages and kept on a diet rich in sugars for 48 hours before starting the experiment, then a suspension was prepared with pure alloxane (hyperglycemia inducing agent) in sodium chloride at a concentration of 130 mg / ml. The rats were administered daily, a dose according to their weight (mg / kg of weight), orally, with a 1 ml syringe without cannula. The experimental animals were separated into groups under suitable conditions and were fed according to the research protocol. Results: In the preliminary phytochemical screening of the hydroalcoholic extract of the caigua Cyclanthera pedata, the presence of secondary metabolites was identified, finding the sterols and triterpenes in greater quantity followed by phenolic composition and catechimes in regular quantity, the hypoglycemic effect was demonstrated after In a series of tests carried out on rats, it was determined that in the treatment administered for 96 hours, the hydroalcoholic extract of the fruit of Cyclanthera Pedata gave its hypoglycemic effect at a concentration of 1000mg conclusion: the extract of the fruit of Cyclanthera pedata presented a significant difference among the 5mg glibenclamide in Rattus norvergicus Holtzman. Key words: Cyclanthera pedata, Phytochemical analysis, hypoglycemic effect, diabetes. 8 9 I. INTRODUCCIÓN La diabetes es una fuente de alto riesgo para adquirir enfermedades visuales, cerebrales, nefropatías y cardiovasculares que se presenta con mayor frecuencia hoy en día en nuestra población, afectando a más de dos millones de personas, no obstante, la mayor parte de la población desconoce acerca de este mal (1)(2). Según la OMS (Organización mundial de la salud) en el año 2000, 151 millones de personas adultas presentaron diabetes. En el 2009, este número creció a 285 millones de pacientes en el 2010, la proyección mundial de casos para 2025 era de 438 millones; faltando cinco años para esa fecha, esa predicción ya ha sido superada en 25 millones (3)(4) (Anexo B). En el Perú, los reportes estadísticos de sus DIRESAS (Direcciones regionales de salud) de los años 2017- 2019, muestra que los mayores casos de diabetes se presentaron en Lima (Diris Lima Centro con 4916 casos, Diris Lima Norte con 2814, Lima Provincias con 1076) seguido de las regiones La Libertad (3737), Ancash (1857), Junín (1511), Ica (1240), Tacna (1236) (5). “Las enfermedades relacionadas a los malos hábitos alimenticios matan 11 millones de personas en el mundo al año” (6). Si bien el Perú es el país con el menor nivel de mortalidad en Latinoamérica, ello no implica necesariamente que el peruano promedio tenga una alimentación sana y equilibrada. En efecto, la dieta común en Perú carece de proporciones adecuadas de frutas, vegetales, cereales integrales, semillas oleaginosas y fuentes de Omega 3 (como las nueces o el maní) (2). El fármaco más común de prescripción médica para afrontar la diabetes es la glibenclamida, pero, existe un potencial tratamiento alternativo a través del extracto de la caigua que puede utilizarse como suplemento alimenticio para la prevención, o incluso como ayuda a la terapia farmacológica convencional. El fruto de esta planta es considerado como un alimento funcional, puesto que se ha demostrado que reduce los niveles de colesterol y lípidos de la sangre (7)(19) Cabe resaltar que en 2013 una investigación, llevada a cabo en la Universidad Wiener brindó evidencia que un preparado alimenticio en base a caigua 10 aparentemente lograba disminuir los niveles de glucosa en sangre, aunque el método empleado tenía matices empíricos (19) Por la alta biodiversidad en recursos botánicos, el empleo de plantas medicinales en Perú es, y ha sido, bastante común y recurrente en el país a lo largo de su historia, tal como ha señalado el Dr. Fernando Cabieses, que los recursos terapéuticos nacionales han sido aplicados ampliamente en la farmacoterapia y medicina también en la industria de perfumería, jabonería, insecticidas, entre otras (8). La caigua (Cyclanthera pedata) es una planta trepadora, cuyos tallos miden 5 m de largo, sus ramas son aristadas y tiene 20 pendientes que se despedazan en 5 ramas. Su hoja es de 6 a 14 cm de largo (9) (10). Es cultivada en el Perú donde se encuentran los ejemplares más primitivos. El fruto de la caigua puede ser empleado en comidas, en la medicina tradicional, su consumo tiene un efecto terapéutico reduciendo el colesterol, diurético, glucosa y efecto antinflamatorio. El fruto de la planta es el más usado ya que contienen flavonoides, alcaloides, taninos, polifenoles, cumarinas, ácido galacturónico y picrina (11). Se ha observado que la fibra de la caigua reduce la filtración de bilis en el colon, afectando al reciclaje en el círculo enterohepático; por lo tanto, de manera indirecta reduce la absorción de lípidos y colesterol al espacio portal, por consiguiente, disminuyendo la cantidad de estos en la sangre (12). Villegas y Huamán (2018), realizaron un estudio experimental, prospectivo longitudinal, donde indujeron a hipercolesterolemia a los conejos, luego administraron tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto de Caigua siendo la concentración de 500 mg la que evidencio una disminución significativa (p<0.05) de Colesterol y Triglicéridos en comparación al grupo negativo, demostrando así tener efecto más alto sobre el hipercolesterolemia en relación a la atorvastatina de 10 mg (11). Campos y Quintana (2013), desarrollaron un estudio para demostrar una alternativa de tratamiento con la ensalada de caigua (Cyclanthera pedata) en damas que presentaron hiperglicemia e hiperlipidemia; con niveles iniciales de glucosa y lípidos entre 178,13 y 326,58 mg/dl, para ello le administraron 30 gramos de caigua en ensalada por dos meses y en ayunas a cada una. Al concluir el tratamiento las 11 concentraciones glucosa y lípidos cayeron a 89,02 y 195,44 mg/dl, individualmente evidenciando así una alternativa terapéutica para los casos de diabetes (13). Castañeda B. et al (2012), evaluaron la acción de Cyclantera pedata l. (caigua) para prevenir la dislipidemia en conejos inducidas por consumo de colesterol y aceite vegetal, los grupos que consumieron extracto de caigua por tres meses en concentraciones de 250, 500 y 1000 mg/Kg impidió la formación de colesterol y disminuyo los triglicéridos en la sangre (14). Br. charqui (2013) realizo un estudio para demostrar la importancia de la caigua (Cyclanthera pedata) en personas con diabetes mellitus tipo 2, estudio a 350 personas, al cual se diagnosticó a 37 personas con diabetes al cual ellos realizaron el tratamiento, utilizo el procedimiento enzimático, y estadístico aplicando la prueba t-student y Kolmogórov. Para el procedimiento de la caigua utilizó 20g a través de una ensalada, una vez por semana por 3 meses. Al finalizar el tratamiento las 37 personas bajaron su nivel de glucosa. antes de realizar del tratamiento tenían la glucosa elevada con142,78 mg/dL y después del tratamiento con la caigua bajaron a 85,15 mg/dL. Demostrando su eficacia (19). Soto, et al. (2009), realizaron una investigación para determinar el efecto de la caigua (Cyclantera pedata) sobre el perfil lipídico, administrando cápsulas liofilizada de caigua, siendo cada una equivalente a 400 mg de extracto, por 45 días a 25 sujetos varones con hipercolesterolemia entre 40 y 65 años, luego hicieron un control sérico del perfil lipídico (colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos), demostrando que el tratamiento con cuatro cápsulas liofilizadas de caigua en ayunas redujo significativamente el colesterol total inicial en un promedio de 93 mg/ dL o 33,8% del valor inicial, reduciendo el colesterol LDL de 88 mg/ dL o 44%, del valor inicial mientras que las variaciones del colesterol HDL y los triglicéridos no fueron significativas (15). El presente estudio pretende, a nivel teórico, incrementar el conocimiento científico de las propiedades etno-farmacológicas de los recursos botánicos peruanos evaluando actividad farmacológica del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata cultivar serrana, resaltando que se cuenta con evidencia empírica y científica sobre alguna de sus propiedades beneficiosas y composición fitoquímica, encontrándose compuestos polifenólicos como los flavonoides que, 12 según varios estudios, pueden solucionar problemas del metabolismo de la glucosa. Así mismo, se busca incentivar la exploración de nuevas moléculas con acción terapéutica para la diabetes, una enfermedad que representa un problema de salud pública que sigue en aumento (16). Por tal motivo la presente investigación tiene como objetivo evaluar el efecto hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata cultivar serrana en Rattus norvergicus Holtzman En este contexto, la hipótesis de nuestro estudio señala que al menos una dosis específica del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata cultivar serrana tiene efecto hipoglucemiante en Rattus norvergicus Holtzman. 13 II. MATERIALES Y METODOS 2.1. Enfoque y diseño de la investigación. El presente estudio es de enfoque cuantitativo y diseño experimental porque se manipula la variable no comprobada o independiente (Extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata) siendo vigiladas, se dice cuál es la causa que lo hace individual, para estudiar sus consecuencias sobre la variable dependiente (El nivel de glucosa en sangre de Rattus norvergicus Holtzman) respetando los criterios expuestos de Hernández, Fernández y Baptista. Según su finalidad, la investigación es de tipo aplicativa ya que modifica la variable dependiente por medio de la aplicación de la variable independiente, buscando con ello aportar a la solución de la realidad de la problemática (17). 2.2. Población, muestra y muestreo 2.2.1. Población En el presente estudio se trabajó con el fruto de la caigua (Cyclanthera pedata) cultivar serrana, del distrito de Santa Anita, provincia Lima y con Rattus norvergicus Holtzman. 2.2.2. Muestra: ● 120 unidades de Frutos de la caigua (Cyclanthera pedata) cultivar serrana del Perú. El muestreo fue de tipo no probabilístico por conveniencia recolectados en el mercado mayorista de santa Anita, distrito del mismo nombre. ● 25 ratas Rattus norvergicus Holtzman) provenientes del Bioterio – UNMSM facultad de ciencias de la salud- Lima. 2.2.3. Criterio de exclusión · Muestra vegetal: Fruto fresco, libre de hongos y mohos, de la especie cultivar serrana · Muestra animal: Ratas con peso 250 mg – 350 mg, procedentes del bioterio de la Universidad San Marcos, Ratas entre 2-3meses 14 2.2.4. Criterio de inclusión. · Muestra vegetal: Fruto dañado, golpeados, con mohos, · Muestra animal: Ratas preñadas de bajo peso infectados o enfermos con malformaciones. 2.3. Variables de investigación. El presente estudio presenta dos variables. La variable independiente, es el “extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata cultivar serrana (ANEXO A) y La variable dependiente es el efecto hipoglucemiante de Rattus norvergicus Holtzman. 2.3.1. Definición conceptual: ⮚ Los extractos hidroalcohólicos; La caigua es un fruto que tiene propiedades terapéuticas que contiene vitaminas, minerales, compuestos esteroidales, 3 beta –D glucósido al que se debe su poder hipoglucemiante. ⮚ Efecto Hipoglucemiante: Capacidad de disminuir los niveles de glucosa e incrementar los valores de insulina en sangre. (ANEXO A). 2.3.2. Definición operacional: ⮚ El extracto hidroalcohólico de La caigua (Cyclanthera pedata) Cantidad adecuada en la concentración del principio activo para luego ser aplicado al tratamiento. ⮚ Tiempo transcurrido para obtener resultados sobre su capacidad de disminuir los niveles de glucosa en sangre, si posee efecto hipoglucemiante sobre hiperglucemia inducida. 2.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos (Validación de los instrumentos de recolección de datos). Las técnicas que se usó durante la recolección de datos fueron de tipo cualitativo empleados comúnmente en los estudios experimentales. Por tal motivo se emplearon instrumentos de recolección de datos diseñados para 15 examinar las variables relacionadas a un estudio experimental de tipo farmacológico, enfocado en la actividad hipoglicemiante (Anexo B). 2.5. Plan de recolección de datos 2.5.1. Recolección y selección de muestra La especie vegetal en estudio fue comprada en el mercado mayorista de santa Anita, se hizo la selección de los frutos de caigua frescos y en buen estado. Su clasificación taxonómica de la muestra vegetal se analizó en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Lima. 2.5.2. Preparación del extracto hidroalcohólico de la Cyclanthera pedata. Después de seleccionar los frutos más frescos y adecuados se procedió a limpiar con alcohol de 96° para evitar contaminaciones. Se dejó secar la caigua a temperatura ambiente por 30 min, luego se llevó a la estufa a 43.5° por un periodo de 3 días. El material vegetal seco, se colocó en un frasco de vidrio ámbar y se agregó 1 litro de alcohol de 70º. Luego se agito y se mezcló hasta que se cubra toda la muestra. Se tapó el frasco y se dejó por 15 días agitando diariamente por un tiempo de 5 minutos, al terminar los 15 días se procedió a filtrar separando lo solido del líquido, se dejó el macerado por 5 minutos y se filtró por otra vez utilizando doble papel filtro y gasa. La muestra obtenida se colocó en el rota vapor por un periodo de dos días. 2.5.3. Ensayo Fotoquímico. Se realizó mediante reacciones de coloración y precipitación. Se disolvió 0.5 g de extracto seco para cada uno de los diferentes ensayos y se procedió a realizar el tamizaje fotoquímico empleando los siguientes reactivos Borntrager, Cloruro férrico, Liebermann-Burchard, Wagner, Dragendorff, Mayer, Baljet, Gelatina-sal, Gelatina, NaOH, Fehling, Benedict, Molish y Shinoda (Anexo C). 16 2.5.4. Adquisición de Animales de experimentación. La especie animal en estudio fue comprada en el Bioterio de la facultad de medicina de la UNMSM – Lima fueron adquiridos 25 ratas de 2 a 3 meses de edad, con un peso aproximado de 250 a 300 gramos. 2.5.5. El protocolo de ensayo del tratamiento. En la investigación se formaron 5 grupos de 5 ratas, que fueron divididas aleatoriamente de la siguiente manera: Grupo Blanco (suero fisiológico), Grupo C. Negativo (aloxano), Grupo C. Positivo Glibenclamida Grupo experimental 1 (Extracto de Cyclanthera pedata 750mg), Grupo experimental 2 (extracto de Cyclanthera pedata 1000mg/kg/día). Los animales se alojaron en jaulas metálicas y se mantuvieron en dieta rica en azúcares durante 48 horas antes de comenzar el experimento. El aloxano se utilizó como agente hiperglucémico que fue diluido 130mg/kg que fueron administrado a todos los grupos excepto al Grupo Blanco (suero fisiológico). Tabla 1: Grupos experimentales para evaluar el efecto hipoglucemiante de extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera pedata DISEÑO DE INVESTIGACION GRUPO Grupo Grupo Grupo Control Control Grupo GrupoBlanco Negativo Positivo experimental 1 experimental 2 INDUCCION TGO -- Aloxano Aloxano Aloxano Aloxano Vehículo de TRATAMIENTO Agua administració Glibenclamida Extracto de Extracto de destilada Cyclanthera Cyclantheran pedata pedata NUMERO DE ANIMALES 5 5 5 5 5 DOSIS 5mg 750mg/kg 1000 mg/kg VIA DE ADMINISTRACION oral oral Oral oral oral Fuente: elaboración propia. 17 2.5.5.1. Inducción a la hiperglucemia en animales de experimentación. Se preparó una suspensión con aloxano (agente inductor a hiperglicemia) puro en cloruro de sodio a una concentración de 130 mg/ml. Se les administro a las ratas, una dosis diaria, durante 2 dias de acuerdo a su peso (mg/kg de peso), vía oral, con jeringa de 1 ml sin cánula. Los animales experimentales fueron separados por grupos en condiciones adecuadas y se les alimento de acuerdo con el protocolo de investigación. 2.5.5.2. Administración de tratamientos. Pasados siete días (2 días de inducción y 5 de aclimatación) se administró el fármaco glibenclamida (Control Positivo) 5 mg/kg comparando efecto con el extracto hidroalcohólico de la Cyclanthera pedata cultivar serrana en dosis de 750mg/kg y 1000mg/kg. Luego de 2 horas de administración del tratamiento se tomaron muestras sanguíneas del ápice de la de la cola del animal, desechando la primera gota y recibiendo la siguiente sobre la tira reactiva, los niveles de glucosa serán determinados usando un glucómetro digital ACCU-CHEK® y se utilizó tiras reactivas ACCU- CHEK® del Laboratorio ROCHE DIAGOSTICO, siguiendo las instrucciones respectivas. 2.6. Métodos de análisis estadístico. Los datos fueron presentados mediante medidas de tendencias y analizados mediante estadística inferencial para establecer la relación entre variables empleando el software estadístico SPSS versión 21 de la compañía IBM. 2.7. Aspectos éticos: Se siguió el manual de manejo de animales de experimentación del Instituto Nacional de Salud del Perú que plantea lo siguiente: Los profesionales en investigación que experimentan con animales están en la obligación moral de demostrarles tres tipos de actitudes: Respeto, afecto y agradecimiento. ⮚ Respeto: Porque son seres vivos y sensitivos y son afectados experimentando padecimiento y en algunos casos terminan 18 perdiendo la vida; tratarlos con todos los miramientos que el caso amerita. ⮚ Afecto: Considerándolos coparticipes del misterio de la vida. ⮚ Gratitud: Valoración y estima por la significativa ayuda al constituirse en nuestros más taxativos coadjutores. Asimismo, se continuará con el apreciable principio de las tres R de la experimentación humanizada con los animales propuesta por William Russell (zoólogo y psicólogo) y Rex Burch (microbiólogo) en 1959: ⮚ Reducir al máximo la cifra de animales utilizados en investigación. ⮚ Substituir siempre que sea permisible el animal de experimentación por otro modelo experimental cuando no resulte imprescindible el uso del animal. Refinamiento de las metodologías y técnicas utilizados de modo que generen al animal el mínimo sufrimiento posible (18). 19 III. RESULTADOS 3.1. Ensayo Fitoquímico Preliminar Tabla 2: Ensayo Fitoquímico preliminar del extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera pedata PRUEBA EFECTUADA METABOLITOS RESULTADOS Cloruro férrico Compuestos polifenolicos + + Shinoda flavonoides + Bomtranger antraquinonas - Lieberman esteroles + + + Lieberman triptenos + + + espuma saponinas + ninhidrina aminoácidos - baja temperatura mucilagos - Carbonato de sodio + luz ultravioleta caquetinas + + Leyenda: Abundante (+++), Regular (++), Escaso (+), Ausencia (-) En la Tabla 2 se observan los resultados del análisis cualitativo fitoquímico del extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata por medio de reacciones de coloración y precipitación, se identificó la presencia de esteroles y triterpenos en mayor cantidad seguidos de compuestos polifenólicos y catequinas en regular cantidad, saponinas es escasa cantidad y ausencia de antraquinonas y mucilagos; según la literatura, se cuenta con evidencia de que los esteroles y triterpenos de recursos botánicos tienen relación con un efecto hipolipemiante y/o hipoglicemiante. 20 3.2. Evaluación de la actividad hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de cyclanthera pedata en ratas hiperglucémicas inducidas con ALOXANO Tabla 3: Registro de dosis y frecuencia de tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto Cyclanthera pedata TRATAMIENTOS ADMINISTRADOS Grupos formados BASAL INDUCIDO 24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS 96 HORAS 1 63 78 76 75 73 74 2 57 80 78 77 75 75 GRUPO BLANCO (suero fisiológico) 3 73 92 94 91 89 88 4 62 60 59 57 60 60 5 43 50 52 50 52 53 1 56 600 500 513 529 568 2 50 72 70 56 84 66 GRUPO CONTROL POSITIVO (aloxano) 3 45 590 593 596 598 600 4 57 597 600 600 600 600 5 54 543 560 570 585 595 1 79 598 599 600 600 600 GRUPO CONTROL 2 42 599 600 598 599 600 NEGATIVO ( glibenclamida 5mg + 3 51 600 600 600 599 599 aloxano) 4 38 596 597 599 482 492 5 52 599 600 598 600 599 1 40 590 593 595 502 362 GRUPO 2 48 560 564 564 450 360 EXPERIMENTAL1 3 60 570 576 560 580 560 (Extracto de 750 mg) 4 45 549 569 560 576 440 5 39 421 430 430 437 440 1 77 533 540 531 490 317 GRUPO 2 40 546 475 471 418 284 EXPERIMENTAL2 3 42 545 534 534 482 314 (Extracto de 1000 mg) 4 44 581 591 570 336 283 5 46 560 573 555 490 320 Fuente: Elaboración propia En la Tabla 3 se muestran los valores de glucosa antes y durante la administración de los tratamientos en los siguientes grupos: grupo blanco (suero fisiológico), grupo control positivo (aloxano), grupo control negativo (glibenclamida 5mg + aloxano), grupo experimental 1 (extracto de 750mg), grupo experimental 2 (extracto de 1000mg) 21 Figura 1: Tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera pedata de ratas hiperglucémicas inducidas con Aloxano Fuente: Elaboración propia. En la siguiente Figura 1 se observa la homogeneidad en el nivel de glicemia basal del grupo blanco evidenciando la ausencia de variables intervinientes que pudieran afectar el nivel de glicemia de las ratas. Así mismo se observa el incremento en el nivel de glicemia de las ratas del grupo inducido al cual se les administró Aloxano y los cambios significativos que muestran en el nivel de glicemia entre los grupos experimentales (grupos control positivo, control negativo y niveles de tratamiento). Entre los grupos experimentales, a las 24 horas aún no se muestran cambios resaltantes en el nivel de glicemia; a las 48 horas se va mostrando un ligero cambio en el grupo experimental “Control Positivo”. A las 72 horas se va perfilando diferencias en la glicemia de los grupos experimentales y a las 96 horas se puede evidenciar un cambio estadístico significativo entre los grupos experimentales en el cual se destaca que el grupo experimental 2 (extracto de 1000mg) se ha diferenciado significativamente de los otros grupos experimentales (grupo experimental 1 [extracto de 750mg] y grupo control negativo [glibenclamida 5mg] ), brindando evidencia de un potencial efecto hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico del fruto de la cyclanthera pedata cultivar serrana; aunque es necesario analizar a nivel estadístico los datos para obtener resultados más concluyentes. 22 Los niveles de glicemia obtenidos fueron sometidos a pruebas estadísticas (Kolmogorov-Smirnov y Levene) con el fin de determinar si se ajustan a la función normal (Anexo D) y si son homocedasticas (varianzas homogeneas) entre los grupos experimentales (Anexo E); de manera que puedan ser sometidas a pruebas paramétricas (ANOVA) o no paramétricas (Kruskal-Wallis) según sea el caso. 3.2.1. ANOVA de las Glicemias Basales de los grupos experimentales Tabla 4: Análisis de varianza (ANOVA) del promedio de glicemias basales de las ratas normo glicémicas de los grupos experimentales GLIC_BASAL Suma de Media cuadrados gl cuadrática F Sig. Entre grupos 471,040 4 117,760 ,832 ,521 Dentro de grupos 2831,600 20 141,580 Total 3302,640 24 · H0 (sig > p= 0.05): Las medias estadísticas de los niveles de glicemia de los grupos experimentales no difieren entre sí. · H1 (sig < p= 0.05): Al menos la media estadística de los niveles de glicemia de un grupo experimental difiere con el resto. En la Tabla 4 se muestra el ANOVA de las medias de glicemia basal entre los grupos experimentales. Se muestra un valor de significancia (a=0.521) mayor a p=0.05; por lo que se acepta la hipótesis estadística nula asociada a ANOVA (Ho). Por lo tanto se estima que los valores de glicemia basal de las ratas es estadísticamente similar entre los grupos experimentales, demostrando que las ratas utilizadas para el análisis experimental estuvieron en buen estado sin presencia de patologías o variables intervinientes que pudieran los resultados obtenidos durante la administración de los tratamientos. 23 3.2.1.1 Pruebas Post-Hoc (ANOVA primera parte): Corresponde HSD de Tukey Tabla 5: Subconjunto homogéneo (HSD de Tukey) del promedio de glicemia basales de ratas normo glicémicas HSD Tukeya GRUPO_EXP N Subconjunto para alfa = 0.05 1 GrupoE1 - 750 5 46,4000 GrupoE2 - 1000 5 49,8000 Grupo Control Negativo 5 52,4000 Grupo Control Positivo 5 52,4000 Grupo Blanco 5 59,6000 Sig. ,426 En la Tabla 5: Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos (a=0.426). Se observa la formación de un solo subconjunto homogéneo, ratificando el resultado del ANOVA (Tabla 4) que los niveles de glicemia basal son similares entre todos los grupos experimentales. 3.2.2. Análisis de Varianza (ANOVA) del nivel de glicemia de rattus norvergicus Holtzman luego de la inducción con Aloxano y durante los tratamientos de los grupos experimentales. Tabla 6: Análisis de varianza ANOVA del promedio de glicemia de las ratas hiperglicémicas inducidas con aloxano y tratadas con extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata 24 Suma de Media cuadrados gl cuadrática F Sig. GLIC_INDUCIDO Entre grupos 920851,360 4 230212,840 19,921 ,000 Dentro de grupos 231126,400 20 11556,320 Total 1151977,760 24 GLIC_24H Entre grupos 916238,640 4 229059,660 20,152 ,000 Dentro de grupos 227329,200 20 11366,460 Total 1143567,840 24 GLIC_48H Entre grupos 908770,400 4 227192,600 18,992 ,000 Dentro de grupos 239247,600 20 11962,380 Total 1148018,000 24 GLIC_72H Entre grupos 794179,760 4 198544,940 16,097 ,000 Dentro de grupos 246684,400 20 12334,220 Total 1040864,160 24 GLIC_96H Entre grupos 774489,760 4 193622,440 14,954 ,000 Dentro de grupos 258957,200 20 12947,860 Total 1033446,960 24 · H0 (sig > p= 0.05): Las medias estadísticas de los niveles de glicemia de los grupos experimentales no difieren entre sí. · H1 (sig < p= 0.05): Al menos la media estadística de los niveles de glicemia de un grupo experimental difiere con el resto. En la Tabla 6 se observa que los valores de significancia (a), resaltados en rojo, obtenidos son menores a p=0.05 en todas las horas que fueron tomadas las muestras de análisis. Ello nos indica que al menos la media de glicemia de un grupo experimental es diferente al resto de grupos. Sin embargo, debido a que los datos de glicemia resultaron en ser “no normales” (Anexo D), un prueba ANOVA no es concluyente por lo que se requiere realizar pruebas no paramétricos. Se realizó una prueba de confirmación H de Kruskal Wallis (no parametrica). 3.2.2.1 H de Kruskal Wallis (Prueba de confirmación). 25 Tabla 7: Prueba no paramétrica de Kruskal Wallis de la distribución de los niveles de glicemia luego de la inducción y durante los tratamientos con el extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata GLIC_INDU GLIC_2 GLIC_4 GLIC_7 GLIC_9 CIDO 4H 8H 2H 6H H de Kruskal- 15,948 16,317 16,003 15,981 17,249 Wallis gl 4 4 4 4 4 Sig. asintótica ,003 ,003 ,003 ,003 ,002 a. Prueba de Kruskal Wallis b. Variable de agrupación: GRUPO_EXP · H0 (sig > p= 0.05): La distribución entre los datos de los niveles de glicemia es la misma entre las categorías de los grupos experimentales. · H1 (sig < p= 0.05): La distribución entre los datos de los niveles de glicemia no es la misma entre las categorías de los grupos experimentales. Figura 2: Prueba de hipótesis tés paramétrico de Kruskal Wallis de la distribución de los niveles de glicemia luego de la inducción y durante los tratamientos con el extracto hidroalcohólico de Cyclanthera pedata 26 En la Tabla 7 y Figura 2 se observa que los valores de significancia (a) obtenidos, resaltados en rojo, son menores a p=0.05 en todas las horas que fueron tomadas las muestras de análisis por lo que se rechaza la hipótesis nula asociada a Kruskal- Wallis (Ho). Con ello se concluye que hay una diferencia de medias (y de distribución de datos) en las medias de niveles de glicemia en al menos un grupo experimental en comparación con los demás. Para determinar que media de nivel de glicemia de un grupo experimental es diferente al resto de grupos experimentales se realizó un prueba Post Hoc, según se muestra en el anexo E, del cual se muestran los subconjuntos homogéneos formados. Tabla 8: Subconjuntos homogéneos (PRUEBA DE GAMES-HOWELL) de los niveles de glicemia luego de la inducción con ALOXANO en Rattus norvergicus holtzman Subconjunto para alfa = 0.05 GRUPO_EXP N 1 2 3 Grupo Blanco 5 72,0000 Grupo Control Negativo 5 480,4000 480,4000 480,4000 GrupoE1 - 750 5 538,0000 538,0000 GrupoE2 - 1000 5 553,0000 Grupo Control Positivo 5 598,4000 Sig. 0,071 ,436 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5.000. En la Tabla 8 se observa que una clara elevación de los niveles de glicemia inducidos por la administración de aloxano en los grupos experimentales en comparación con el grupo blanco. Se observa la mayor elevación del nivel de glicemia se da en el grupo control positivo. También se observa una ligera similitud estadística entre el nivel de glicemia del grupo “Control negativo” y del grupo “Blanco”, sin embargo su valor de a=0.071 es despreciable en comparación con el valor de a=0.436 obtenido por el subconjunto homogéneo 2; por lo tanto se asume que el grupo blanco y control negativo tienen diferentes niveles de glicemia para todos los casos posteriores en los cuales se observa similares resultados. 27 Tabla 9: Subconjuntos homogéneos (PRUEBA DE GAMES-HOWELL) de los promedios de niveles de glicemia de ratas hiperglucémicas luego de 24 horas de tratamiento. Subconjunto para alfa = 0.05 GRUPO_EXP N 1 2 Grupo Blanco 5 71,8000 Grupo Control Negativo 5 464,6000 464,6000 GrupoE2 - 1000 5 542,6000 GrupoE1 - 750 5 546,4000 Grupo Control Positivo 5 599,2000 Sig. 0,074 ,303 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5.000. En la Tabla 9 se observa que a las 24 de horas de tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclantera pedata hay igualdad estadística en el nivel de glicemia en sangre en los grupos experimentales; grupo control negativo (glibenclamida 5mg), grupo control positivo (aloxano), grupo experimental 1(750mg) y experimental 2 (1000mg) siendo todos estos parte de un mismo sub-grupo como se muestra en la tabla mencionada. 28 Tabla 10: Subconjuntos homogéneos (PRUEBA DE GAMES-HOWELL) de los niveles de glicemia de ratas hiperglucémicas luego de 48 horas de tratamiento. Subconjunto para alfa = 0.05 GRUPO_EXP N 1 2 Grupo Blanco 5 70,0000 Grupo Control Negativo 5 467,0000 467,0000 GrupoE2 - 1000 5 532,2000 GrupoE1 - 750 5 541,8000 Grupo Control Positivo 5 599,0000 Sig. 0,08 ,345 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5.000. Tabla 11: Subconjuntos homogéneos (PRUEBA DE GAMES-HOWELL) de los promedios de niveles de glicemia de ratas hiperglucemicas luego de las 72 horas de tratamiento Subconjunto para alfa = 0.05 GRUPO_EXP N 1 2 HSD Tukeya Grupo Blanco 5 69,8000 GrupoE2 - 1000 5 443,2000 Grupo Control Negativo 5 479,2000 479,2000 GrupoE1 - 750 5 509,0000 Grupo Control Positivo 5 576,0000 Sig. 0,064 ,354 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5.000. En la Tabla 10 y Tabla 11 se observan que a las 48 y 72 horas de tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclantera pedata no se evidencian cambios resaltantes en la disminución de glicemia evidenciando similitud estadística entre ellas, ni diferencia estadísticas resaltantes entre los grupos experimentales (exceptuando el grupo blanco). 29 Tabla 12: Subconjuntos homogéneos (PRUEBA DE GAMES-HOWELL) de promedio de glicemia de ratas hiperglucemicas luego de 96 horas de tratamiento Subconjunto para alfa = 0.05 GRUPO_EXP N 1 2 3 Grupo Blanco 5 70,0000 GrupoE2 - 1000 5 303,6000 GrupoE1 - 750 5 432,4000 432,4000 Grupo Control Negativo 5 485,8000 485,8000 485,8000 Grupo Control Positivo 5 578,0000 Sig. 0,072 ,123 ,291 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5.000. En la Tabla 12, a las 96 horas tratamiento con el extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclantera pedata se muestra la formación de 3 subconjuntos homogéneos cada una con un nivel de significancia propio. En el subconjunto homogéneo 3 se puede visualizar que se mantiene una similitud entre el grupo control negativo y control positivo con una significancia de 0.291; por lo que se concluye que el tratamiento farmacológico con Glibenclamida 5mg/Kg/día no logró disminuir los niveles de glicemia luego de 92 horas de tratamiento En el grupo 2 se muestra una similitud con el grupo experimental 1 (extracto 750mg) y el grupo control negativo (glibenclamida) con una nivel de significancia menor de 0.123; resaltando que el grupo experimental 2 (extracto 1000mg) se diferencia del grupo control positivo (aloxano) acercándose al grupo blanco (suero fisiológico) mostrando el efecto hipoglucemiante con un mayor nivel de significancia. 30 IV. DISCUSIÓN 4.1 Discusión de resultados La presente investigación se realizó con el propósito de demostrar el efecto hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata en Rattus norvergicus Holtzman debido a sus propiedades farmacológicas, resaltando su composición fitoquímica, encontrándose compuestos como los flavonoides, triterpenos, polifenoles, entre otros, los mismos que se ha demostrado pueden solucionar problemas de enfermedades metabólicas (11)(13)(14)(19). Para ello evaluamos un grupo de 25 Rattus norvergicus Holtzman a las cuales se les administró Aloxano 130 mg/ml para inducir hiperglicemia, luego después se le aplico tratamiento con dosis de 750mg/kg, 1000mg/kg de extracto hidroalcohólico los cuales fueron comparados con glibenclamida, obteniendo resultados favorables a partir de las 96 horas de su administración de la dosis de 1000 mg/kg. Además, al evaluar el efecto hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata Cultivar Serrana en Rattus norvergicus Holtzman. y la presencia de metabolitos secundarios de dicho extracto, se determinó que en el tamizaje fitoquímico preliminar existen metabolitos secundarios, observándose que los esteroles y triterpenos están en mayor cantidad además de composición fenólica y catequinas; la presencia de estos metabolitos está relacionados al efecto hipoglucemiante. De acuerdo a Campos y Quintana (2013), desarrollaron un estudio para demostrar una alternativa de tratamiento con la ensalada de caigua (Cyclanthera pedata) para ello le administraron 30 gramos de caigua en ensalada por dos meses, concluyendo a una disminución de hiperglucemia, no obstante, en nuestro estudio se ha demostrado que con 1000mg de extracto dentro de las 96 horas hay un efecto hipoglucemiante. Destacamos el hecho de que el tratamiento (Cyclanthera pedata) tiene características crónicas y requiere un amplio tiempo de tratamiento, por lo que muestra Campos y Quintana, dándoles a ciertos individuos una ensalada de caigua de 30 mg por un tiempo tan largo como por dos meses también se ha podido observar una hiperglicemia; ese trabajo de investigación no contaba con la 31 suficiente evidencia o con una metodología competentemente planteada como para poder demostrarlo con criterios más científicos, sin embargo nuestro estudio brinda mayor evidencia que la presentada por Campos y Quintana, demostrando que efectivamente luego de un tratamiento prolongado incluso con una dosis de 1000 mg hay un efecto hipoglucemiante. Otra relación importante lo encontramos en los descubrimientos de Br. charqui (2013) que demostró la importancia de la caigua (Cyclanthera pedata) en personas con diabetes mellitus tipo 2, utilizando 20g del fruto en una ensalada, una vez por semana por 3 meses. Logrando disminuir la glucosa. Esto es consolida la efectividad del tratamiento con esta planta, ya que en nuestro estudio se formaron 5 grupos de 5 ratas, que fueron divididas aleatoriamente, para las pruebas estadísticas utilizamos el software estadístico SPSS versión 21 de la compañía IBM. para establecer la relación entre variables luego de los 7 días de inducir a las ratas a la hiperglucemia se les administro 750mg y 1000mg/kg/día de extracto del fruto de la caigua Cyclantera pedata obteniendo la disminución de la hiperglucemia dentro las 96 horas. Estos resultados se relacionan parcialmente con lo que sustentan Villegas y Huamán (2018), que el extracto hidroalcohólico del fruto de la Caigua inducida a hipercolesterolemia a conejos con una concentración de 500 mg obtuvieron una disminución significativa de Colesterol y Triglicéridos, sin embargo en nuestro estudio demostramos que con una concentración de 1000mg del extracto del fruto de la caigua hay una diferencia significativa con la glibenclamida 5mg en ratas inducidas a la hipoglucemia. También en el trabajo de Castañeda B. et al (2012), evaluaron la acción de Cyclantera pedata l. (caigua) para prevenir la dislipidemia en conejos inducidas al colesterol, se les administro el extracto por 3 meses en una concentración de 250, 500 y 1000 mg/Kg obtuvieron la disminución de los triglicéridos, comparativamente resaltamos el hecho que nuestra investigación duro 7 días, tiempo menor al de Castañeda B. et al, administrándose las dosis de 750mg y 1000mg/kg/día de extracto del fruto de la Cyclantera pedata en Rattus norvergicus Holtzman obteniendo el efecto hipoglucemiante positivos dentro de las 96 horas , destacando 32 que nuestro estudio la aplicación de la dosis en mayor concentración tiene un efecto en menor tiempo. Consecuentemente a partir de los hallazgos encontrados consideramos la hipótesis de nuestro estudio valida donde señala que al menos una dosis específica del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata cultivar serrana (1000 mg por kg) tiene efecto hipoglucemiante en Rattus norvergicus Holtzman, a los 7 días de tratamiento, esta dosis por lo visto tiene un efecto a nivel crónico por que se observa recién una disminución de la hiperglicemia en las ratas a nivel significativo después de 96 horas de tratamiento, por lo que se consideraría que la caigua tiene un efecto hipoglicemiante luego de un tratamiento prolongado del producto natural. 33 4.2 Conclusiones 1. Se evaluó el efecto hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de la caigua Cyclanthera pedata cultivar serrana en Rattus norvergicus Holtzman. 2. Una dosis de 750 mg/Kg/día del extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera Pedata logra disminuir los niveles de glucemia en ratas hiperglucémicas; aunque dicha disminución no logra diferenciarse significativamente al nivel de glicemia de ratas hiperglucémicas que no recibieron tratamiento alguno. 3. Una dosis de 1000 mg/Kg/día del extracto hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera Pedata logra disminuir los niveles de glucemia de manera significativa en ratas hiperglucémicas luego de un tratamiento de 96 horas. Se destaca que la aplicación de la dosis en mayor concentración tiene un efecto en menor tiempo. 4. El tratamiento con la dosis de 1000mg/Kg/día del extracto del fruto de la Cyclanthera Pedata logra disminuir los niveles de glicemia en ratas con una diferencia significativa a la disfunción de glicemia lograda con el tratamiento con glibenclamida 5mg/Kg/dia en ratas inducidas a hiperglucemia; por lo que se estima que el extracto del fruto de la Cyclanthera Pedata es potencialmente más efectivo que la glibenclamida 5mg/Kg/día en tratamientos crónicos. 4.3 Recomendaciones 1. Se recomienda seguir una investigación más profunda, en los aspectos fitoquímicos y farmacológicos del fruto de Cyclanthera Pedata a beneficio de la medicina tradicional. 2. Seguir con los estudios farmacológicos experimentales del fruto de Cyclanthera Pedata, incluyendo formulaciones farmacéuticas que puedan mejorar su acción farmacológica. 3. A los profesionales de la salud, informar a sus pacientes sobre las propiedades curativas del fruto de Cyclanthera Pedata y demás especies 34 naturales, las mismas que abundan en nuestra región, como una alternativa al tratamiento farmacológico. 4. La universidad UMA, debe continuar fomentando la investigación en plantas y frutos naturales de nuestra patria. 35 V. BIBLIOGRAFIA 1. Chaudhury A, Duvoor C, Reddy Dendi V, Kraleti S, Chada A, Ravilla R et al. Clinical Review of Antidiabetic Drugs: Implications for Type 2 Diabetes Mellitus Management. Frontiers in Endocrinology. 2017;8. 2. Garrido Orrantia N. alimentación en el paciente diabético: la figura de la enfermera como educadora en diabetes [licenciatura]. universidad de la rioja; 2015. 3. International Diabetes Federation. GUÍA DE INCIDENCIA POLÍTICA DE LA NOVENA EDICIÓN DEL ATLAS DE LA DIABETES DE LA FID 2019. Rhys Williams; 2019 p. 1-28. 4. Tafur LR. Situación de la Vigilancia de Diabetes en el Perú, año 2019. 2019; 5. [Internet]. Bvs.minsa.gob.pe. 2020 [cited 23 September 2020]. Available from: http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/2069-2.pdf. 6. The Lancet: Globally, 1 in 5 deaths are associated with poor diet [Internet]. EurekAlert!. 2020 [cited 23 September 2020]. Available from: https://www.eurekalert.org/pub_releases/2019-04/tl-tlg040219.php 7. Hernández Yero A, Torres Herrera O, Carrasco Martínez B, Nasiff Hadad A, Castelo Elías-Calles L, Pérez Pérez L, et al. Tratamiento farmacológico de la prediabetes. Rev Cuba endocrinol. 2011;22(1):36–45. 8. Gallegos Zurita M. Las plantas medicinales: principal alternativa para el cuidado de la salud, en la población rural de Babahoyo, Ecuador. Anales de la Facultad de Medicina. 2016;77(4):327. 9. [Internet]. Siicex.gob.pe. 2020 [cited 23 September 2020]. Available from: http://www.siicex.gob.pe/siicex/resources/fichaproducto/caigua.pdf 10. el huerto - UNALM [Internet]. Lamolina.edu.pe. 2020 [cited 23 September 2020]. Available from: http://www.lamolina.edu.pe/hortalizas/Datosbasicos.html 11. Villegas S, Huaman J. EFECTO DISLIPIDEMICO DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DEL FRUTO DE LA CAIGUA (Cyclanthera pedata) EN CONEJOS INDUCIDOS A HIPERCOLESTEROLEMIA [licenciatura]. Universidad Inca Garcilazo De La Vega; 2018. 12. Carbajal Azcona Á. [Internet]. Eprints.ucm.es. 2020 [cited 23 September 2020]. Available from: https://eprints.ucm.es/22755/1/Manual-nutricion- 36 dietetica-CARBAJAL.pdf 13. CAMPOS TORRES M, QUINTANA MÁRQUEZ N. Tratamiento con ensalada de caigua (Cyclanthera pedata) a mujeres adultas con hipertrigliceridemia en el caserío Santa Rosa, distrito de Lurín (Lima), 2011 [Licenciatura]. NORWER WIENER; 2020. 14. Castañeda B, Castro De La Mata R, Gamarra F, Loja B, Alvarado A, Ibañez L, et al. Evaluation of Cyclanthera Pedata L. (Caigua) in the Prevention of Dyslipidemia and Aortic Atheroma Formation on Oryctolagus Cuniculus (Rabbits). Cult Lima. 2012;26:229–45. 15. Lizaraso Soto M del R, Alvarado-Ortiz Ureta CE. Efecto de la caigua (cyclantera pedata) liofilizada y encapsulada sobre los niveles de colesterolemia en sujetos varones entre 40 y 65 años. Horiz méd. 1997;(4):18–22. 16. Giraldo Bardalama L. EFECTO DEL EXTRACTO ETANOLICO DEL FRUTO DE Physalis peruviana (“AGUAYMANTO”) SOBRE LA GLUCEMIA EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN [Magister]. Universidad Mayor de San Marcos; 2014. 17. Hernández Sampieri R, Mendoza Torres C. Metodología de la investigación. México: McGraw-Hill Education; 2018. 18. Mrad De Osorio A, Cardozo De Martinez C. Centro de Pensamiento en Ética de la Investigación con animales de la Universidad Nacional de Colombia, el camino hacia la formulación de una política pública de uso de animales en investigación. Spei Domus. 2017;12(24). 19. CHARQUI FIGUEROA M. Efecto de la caigua (Cyclanthera pedata) en personas con diabetes tipo 2 del exfundo Santa Rosa de Lurín, 2012 [licenciatura]. Wiener facultad de farmacia y bioquímica; 2013. 37 VI. ANEXOS ANEXO A Tabla 13: Operacionalización de variables VARIABLES DIFINICION DIFINICIONCONCEPTUAL OPERACIONAL DIMENCIONES INDICADORES ESCALA los extractos acuosos son El extracto extractos líquidos hidroalcohólico del concentrados obtenidos de fruto de La caigua Identificación deEXTRACTO (cyclanthera pedata) HIDROALCOHÓLICO la extracción de una planta Metabolitos tienen efecto CONCENTRACION secundarios DEL FRUTO DE o parte de ella utilizando numérica Cyclanthera pedata como solvente alcohol o hipoglucemiante Diferentes agua presentan sedimento, superior a la Concentraciones color y aroma glibenclamida en ratas del extracto características de la planta inducidos ahipoglucemia Existe una Disminuir los niveles de concentración Del glucosa e incrementar los extracto Análisis EFECTO valores de insulina en hidroalcohólico del Farmacológico HIPOGLUCEMIANTE sangre tras la fruto de la caigua Efecto Niveles dehipoglucemiante hiperglucemia: numéricaINMEDIATO administración de (cyclanthera pedata) sustancias con dicha que posee efecto diabetes elevación capacidad. hipoglucemiante sobre de glucosa hiperglucemia 38 ANEXO B Figura 3: Estimación en años de números de adultos con diabetes Proyección proyectada al 2025 39 ANEXO C: Instrumentos de recolección de datos Tabla 14: Instrumento de recolección de datos. Registro de dosis y frecuencias de tratamiento del extracto hidroalcohólica del fruto de cyclanthera pedata TRATAMIENTOS ADMINISTRADOS Grupos formados PESO HORA valor de Dosis 1-500mg Dosis 2- 1000mg Agente inductor valor glucosa glibenclamida valor de glucosa valor de glucosa valor de glucosa (kg) ADM glucosa 5ml 5ml 1 2 GRUPO BLANCO 3 4 5 1 GRUPO 2 CONTROL 3 POSITIVO 4 5 1 GRUPO 2 CONTROL 3 NEGATIVO 4 5 1 GRUPO 2 EXPERIMENTAL1 3 (Extracto de 750 mg) 4 5 1 GRUPO 2 EXPERIMENTAL2 3 (Extracto de 1000 mg) 4 5 40 Anexo D Tabla 15: Prueba de Kolmogorov-Smirnov Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra GLIC_BASA GLIC_INDUCI L DO GLIC_24H GLIC_48H GLIC_72H GLIC_96H N 25 25 25 25 25 25 Parámetros normalesa,b Media 52,1200 448,3600 444,9200 442,0000 415,4400 373,9600 Desv. Desviación 11,73073 219,08691 218,28573 218,71004 208,25307 207,50973 Máximas diferencias Absoluto ,139 ,370 ,298 ,307 ,225 ,175 extremas Positivo ,139 ,244 ,239 ,235 ,188 ,156 Negativo -,114 -,370 -,298 -,307 -,225 -,175 Estadístico de prueba ,139 ,370 ,298 ,307 ,225 ,175 Sig. asintótica(bilateral) ,200c,d ,000c ,000c ,000c ,002c ,047c a. La distribución de prueba es normal. b. Se calcula a partir de datos. c. Corrección de significación de Lilliefors. d. Esto es un límite inferior de la significación verdadera. · H0 (sig > p= 0.05): Todos los datos se distribuyen uniformemente en comparación con la distribución normal. · H1 (sig < p= 0.05):: Todos los datos no se distribuyen uniformemente en comparación con la distribución normal. 41 Anexo E Tabla 16: prueba de homogeneidad Prueba de homogeneidad de varianzas Estadístico de Levene gl1 gl2 Sig. GLIC_BASAL Se basa en la media ,796 4 20 ,542 Se basa en la mediana ,361 4 20 ,833 Se basa en la mediana y con ,361 4 12,367 ,832 gl ajustado Se basa en la media ,635 4 20 ,644 recortada GLIC_INDUCIDO Se basa en la media 5,259 4 20 ,005 Se basa en la mediana 1,011 4 20 ,425 Se basa en la mediana y con 1,011 4 4,575 ,487 gl ajustado Se basa en la media 3,832 4 20 ,018 recortada GLIC_24H Se basa en la media 4,574 4 20 ,009 Se basa en la mediana 1,285 4 20 ,309 Se basa en la mediana y con 1,285 4 4,836 ,390 gl ajustado Se basa en la media 3,438 4 20 ,027 recortada GLIC_48H Se basa en la media 4,859 4 20 ,007 Se basa en la mediana 1,199 4 20 ,342 Se basa en la mediana y con 1,199 4 4,661 ,420 gl ajustado Se basa en la media 3,614 4 20 ,023 recortada GLIC_72H Se basa en la media 3,699 4 20 ,021 Se basa en la mediana ,783 4 20 ,550 Se basa en la mediana y con ,783 4 5,363 ,580 gl ajustado Se basa en la media 2,713 4 20 ,059 recortada GLIC_96H Se basa en la media 4,427 4 20 ,010 Se basa en la mediana ,783 4 20 ,549 Se basa en la mediana y con ,783 4 4,822 ,583 gl ajustado Se basa en la media 3,237 4 20 ,033 recortada · H0 (sig > p= 0.05): Las varianzas son homogeneas. · H1 (sig < p= 0.05): No todas las varianzas son homogeneas. 42 Anexo F Tabla 17: Pruebas Post-Hoc Pruebas Post-Hoc (Pruebas no paramétricas ANOVA con H de Kruskal Wallis): corresponde ames-Howell Comparaciones múltiples Games-Howell Intervalo de confianza al 95% Variable Diferencia de Límite Límite dependiente (I) GRUPO_EXP (J) GRUPO_EXP medias (I-J) Desv. Error Sig. inferior superior GLIC_INDUCIDO Grupo Blanco Grupo Control Negativo -408,40000 102,89538 ,071 -863,3199 46,5199 Grupo Control Positivo -526,40000* 7,54056 ,000 -559,6440 -493,1560 GrupoE1 - 750 -466,00000* 30,94350 ,000 -595,9064 -336,0936 GrupoE2 - 1000 -481,00000* 11,12205 ,000 -519,4969 -442,5031 Grupo Control Negativo Grupo Blanco 408,40000 102,89538 ,071 -46,5199 863,3199 Grupo Control Positivo -118,00000 102,62319 ,778 -574,2009 338,2009 GrupoE1 - 750 -57,60000 106,92128 ,979 -498,6493 383,4493 GrupoE2 - 1000 -72,60000 102,94834 ,945 -527,2764 382,0764 Grupo Control Positivo Grupo Blanco 526,40000* 7,54056 ,000 493,1560 559,6440 Grupo Control Negativo 118,00000 102,62319 ,778 -338,2009 574,2009 GrupoE1 - 750 60,40000 30,02599 ,396 -73,0128 193,8128 GrupoE2 - 1000 45,40000* 8,23165 ,023 9,0609 81,7391 GrupoE1 - 750 Grupo Blanco 466,00000* 30,94350 ,000 336,0936 595,9064 Grupo Control Negativo 57,60000 106,92128 ,979 -383,4493 498,6493 Grupo Control Positivo -60,40000 30,02599 ,396 -193,8128 73,0128 GrupoE2 - 1000 -15,00000 31,11913 ,986 -144,4132 114,4132 GrupoE2 - 1000 Grupo Blanco 481,00000* 11,12205 ,000 442,5031 519,4969 Grupo Control Negativo 72,60000 102,94834 ,945 -382,0764 527,2764 Grupo Control Positivo -45,40000* 8,23165 ,023 -81,7391 -9,0609 GrupoE1 - 750 15,00000 31,11913 ,986 -114,4132 144,4132 GLIC_24H Grupo Blanco Grupo Control Negativo -392,80000 100,49577 ,074 -837,0456 51,4456 Grupo Control Positivo -527,40000* 7,45520 ,000 -560,3341 -494,4659 GrupoE1 - 750 -474,60000* 30,43189 ,000 -602,2726 -346,9274 GrupoE2 - 1000 -470,80000* 21,23911 ,000 -555,3586 -386,2414 Grupo Control Negativo Grupo Blanco 392,80000 100,49577 ,074 -51,4456 837,0456 Grupo Control Positivo -134,60000 100,22225 ,686 -580,1323 310,9323 GrupoE1 - 750 -81,80000 104,47497 ,925 -512,4013 348,8013 GrupoE2 - 1000 -78,00000 102,17642 ,930 -515,3993 359,3993 Grupo Control Positivo Grupo Blanco 527,40000* 7,45520 ,000 494,4659 560,3341 Grupo Control Negativo 134,60000 100,22225 ,686 -310,9323 580,1323 GrupoE1 - 750 52,80000 29,51610 ,482 -78,3635 183,9635 GrupoE2 - 1000 56,60000 19,90477 ,186 -31,8098 145,0098 GrupoE1 - 750 Grupo Blanco 474,60000* 30,43189 ,000 346,9274 602,2726 Grupo Control Negativo 81,80000 104,47497 ,925 -348,8013 512,4013 Grupo Control Positivo -52,80000 29,51610 ,482 -183,9635 78,3635 GrupoE2 - 1000 3,80000 35,59101 1,000 -123,4747 131,0747 GrupoE2 - 1000 Grupo Blanco 470,80000* 21,23911 ,000 386,2414 555,3586 Grupo Control Negativo 78,00000 102,17642 ,930 -359,3993 515,3993 43 Grupo Control Positivo -56,60000 19,90477 ,186 -145,0098 31,8098 GrupoE1 - 750 -3,80000 35,59101 1,000 -131,0747 123,4747 GLIC_48H Grupo Blanco Grupo Control Negativo -397,00000 104,17773 ,080 -857,7471 63,7471 Grupo Control Positivo -529,00000* 7,37564 ,000 -561,6645 -496,3355 GrupoE1 - 750 -471,80000* 29,63849 ,000 -595,9142 -347,6858 GrupoE2 - 1000 -462,20000* 18,41575 ,000 -533,5595 -390,8405 Grupo Control Negativo Grupo Blanco 397,00000 104,17773 ,080 -63,7471 857,7471 Grupo Control Positivo -132,00000 103,91824 ,721 -593,9700 329,9700 GrupoE1 - 750 -74,80000 107,81020 ,949 -522,5845 372,9845 GrupoE2 - 1000 -65,20000 105,27934 ,964 -521,2327 390,8327 Grupo Control Positivo Grupo Blanco 529,00000* 7,37564 ,000 496,3355 561,6645 Grupo Control Negativo 132,00000 103,91824 ,721 -329,9700 593,9700 GrupoE1 - 750 57,20000 28,71306 ,403 -70,4146 184,8146 GrupoE2 - 1000 66,80000 16,88609 ,072 -8,2141 141,8141 GrupoE1 - 750 Grupo Blanco 471,80000* 29,63849 ,000 347,6858 595,9142 Grupo Control Negativo 74,80000 107,81020 ,949 -372,9845 522,5845 Grupo Control Positivo -57,20000 28,71306 ,403 -184,8146 70,4146 GrupoE2 - 1000 9,60000 33,30435 ,998 -112,3521 131,5521 GrupoE2 - 1000 Grupo Blanco 462,20000* 18,41575 ,000 390,8405 533,5595 Grupo Control Negativo 65,20000 105,27934 ,964 -390,8327 521,2327 Grupo Control Positivo -66,80000 16,88609 ,072 -141,8141 8,2141 GrupoE1 - 750 -9,60000 33,30435 ,998 -131,5521 112,3521 GLIC_72H Grupo Blanco Grupo Control Negativo -409,40000 99,84528 ,064 -851,3894 32,5894 Grupo Control Positivo -506,20000* 24,35652 ,000 -607,5333 -404,8667 GrupoE1 - 750 -439,20000* 30,87297 ,000 -570,7331 -307,6669 GrupoE2 - 1000 -373,40000* 30,68518 ,001 -504,0682 -242,7318 Grupo Control Negativo Grupo Blanco 409,40000 99,84528 ,064 -32,5894 851,3894 Grupo Control Positivo -96,80000 102,37402 ,867 -529,0244 335,4244 GrupoE1 - 750 -29,80000 104,11695 ,998 -457,3300 397,7300 GrupoE2 - 1000 36,00000 104,06142 ,996 -391,6572 463,6572 Grupo Control Positivo Grupo Blanco 506,20000* 24,35652 ,000 404,8667 607,5333 Grupo Control Negativo 96,80000 102,37402 ,867 -335,4244 529,0244 GrupoE1 - 750 67,00000 38,26879 ,461 -67,1778 201,1778 GrupoE2 - 1000 132,80000 38,11745 ,051 -,7517 266,3517 GrupoE1 - 750 Grupo Blanco 439,20000* 30,87297 ,000 307,6669 570,7331 Grupo Control Negativo 29,80000 104,11695 ,998 -397,7300 457,3300 Grupo Control Positivo -67,00000 38,26879 ,461 -201,1778 67,1778 GrupoE2 - 1000 65,80000 42,57746 ,565 -81,2959 212,8959 GrupoE2 - 1000 Grupo Blanco 373,40000* 30,68518 ,001 242,7318 504,0682 Grupo Control Negativo -36,00000 104,06142 ,996 -463,6572 391,6572 Grupo Control Positivo -132,80000 38,11745 ,051 -266,3517 ,7517 GrupoE1 - 750 -65,80000 42,57746 ,565 -212,8959 81,2959 GLIC_96H Grupo Blanco Grupo Control Negativo -415,80000 105,29739 ,072 -882,2641 50,6641 Grupo Control Positivo -508,00000* 22,36068 ,000 -600,5109 -415,4891 GrupoE1 - 750 -362,40000* 36,97918 ,002 -522,2892 -202,5108 GrupoE2 - 1000 -233,60000* 10,29369 ,000 -269,8941 -197,3059 Grupo Control Negativo Grupo Blanco 415,80000 105,29739 ,072 -50,6641 882,2641 Grupo Control Positivo -92,20000 107,29464 ,899 -550,5330 366,1330 GrupoE1 - 750 53,40000 111,26365 ,986 -394,8073 501,6073 GrupoE2 - 1000 182,20000 105,44240 ,506 -283,5921 647,9921 Grupo Control Positivo Grupo Blanco 508,00000* 22,36068 ,000 415,4891 600,5109 44 Grupo Control Negativo 92,20000 107,29464 ,899 -366,1330 550,5330 GrupoE1 - 750 145,60000 42,33273 ,065 -9,3313 300,5313 GrupoE2 - 1000 274,40000* 23,03389 ,000 183,1261 365,6739 GrupoE1 - 750 Grupo Blanco 362,40000* 36,97918 ,002 202,5108 522,2892 Grupo Control Negativo -53,40000 111,26365 ,986 -501,6073 394,8073 Grupo Control Positivo -145,60000 42,33273 ,065 -300,5313 9,3313 GrupoE2 - 1000 128,80000 37,39011 ,099 -29,6270 287,2270 GrupoE2 - 1000 Grupo Blanco 233,60000* 10,29369 ,000 197,3059 269,8941 Grupo Control Negativo -182,20000 105,44240 ,506 -647,9921 283,5921 Grupo Control Positivo -274,40000* 23,03389 ,000 -365,6739 -183,1261 GrupoE1 - 750 -128,80000 37,39011 ,099 -287,2270 29,6270 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. 45 Anexo G Figura 5: Preparación del fruto de Figura 4: Filtración del extracto Cyclanthera Pedata hidroalcohólico del fruto de Cyclanthera Pedata Figura 6: Tamizaje Fitoquímico del extracto Hidroalcohólico del fruto de Figura 7: Extracto Hidroalcohólico Cyclanthera Pedata del fruto de Cyclanthera Pedata Figura 8:Inducción a la Glicemia Figura 9: Administración de tratamientos 46