AUTORIZACIÓN Y DECLARACIÓN JURADA DE AUTORÍA Y ORIGINALIDAD Yo, Arévalo Arévalo, Fredy, con DNI 01139518, en mi condición de autor(a) de la tesis/ trabajo de investigación/ trabajo académico presentada para optar el Título Profesional de “Químico Farmacéutico”, AUTORIZO a la Universidad María Auxiliadora (UMA) para reproducir y publicar de manera permanente e indefinida en su repositorio institucional, bajo la modalidad de acceso abierto, el archivo digital que estoy entregando, en cumplimiento a la Ley N°30035 que regula el Repositorio Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación de acceso abierto y su respectivo Reglamento. Asimismo, DECLARO BAJO JURAMENTO1 que dicho documento es ORIGINAL con un porcentaje de similitud de 19 % y que se han respetado los derechos de autor en la elaboración del mismo. Además, recalcar que se está entregado la versión final del documento sustentado y aprobado por el jurado evaluador. En señal de conformidad con lo autorizado y declarado, firmo el presente documento a los 23 días del mes de octubre del año 2022. __________________________________ __________________________________ Arévalo Arévalo, Fredy Dr. Vílchez Cáceda, Héctor Alexander DNI: 01139518 DNI: 07534022 1 Se emite la presente declaración en virtud de lo dispuesto en el artículo 8°, numeral 8.2, tercer párrafo, del Reglamento del Registro Nacional de Trabajos conducentes a Grados y Títulos – RENATI, aprobado mediante Resolución de Consejo Directivo N° 033-2016-SUNEDU/CD, modificado por Resolución de Consejo Directivo N° 174- 2019-SUNEDU/CD y Resolución de Consejo Directivo N° 084-2022-SUNEDU/CD. ii AUTORIZACIÓN Y DECLARACIÓN JURADA DE AUTORÍA Y ORIGINALIDAD Yo, Suarez Hilario, Nelson Guillermo con DNI 44513295, en mi condición de autor(a) de la tesis/ trabajo de investigación/ trabajo académico presentada para optar el Título Profesional de “Químico Farmacéutico”, AUTORIZO a la Universidad María Auxiliadora (UMA) para reproducir y publicar de manera permanente e indefinida en su repositorio institucional, bajo la modalidad de acceso abierto, el archivo digital que estoy entregando, en cumplimiento a la Ley N°30035 que regula el Repositorio Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación de acceso abierto y su respectivo Reglamento. Asimismo, DECLARO BAJO JURAMENTO2 que dicho documento es ORIGINAL con un porcentaje de similitud de 19 % y que se han respetado los derechos de autor en la elaboración del mismo. Además, recalcar que se está entregado la versión final del documento sustentado y aprobado por el jurado evaluador. En señal de conformidad con lo autorizado y declarado, firmo el presente documento a los 23 días del mes de octubre del año 2022. __________________________________ __________________________________ Suarez Hilario, Nelson Guillermo Dr. Vílchez Cáceda, Héctor Alexander DNI: 44513295 DNI: 07534022 2 Se emite la presente declaración en virtud de lo dispuesto en el artículo 8°, numeral 8.2, tercer párrafo, del Reglamento del Registro Nacional de Trabajos conducentes a Grados y Títulos – RENATI, aprobado mediante Resolución de Consejo Directivo N° 033-2016-SUNEDU/CD, modificado por Resolución de Consejo Directivo N° 174- 2019-SUNEDU/CD y Resolución de Consejo Directivo N° 084-2022-SUNEDU/CD. iii iv FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LOS BOTONES FLORALES DE Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) SOBRE Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741 TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES Bach. ARÉVALO ARÉVALO, FREDY https://orcid.org/0000-0003-4248-2389 Bach. SUAREZ HILARIO, NELSON GUILLERMO https://orcid.org/0000-0001-7736-5911 ASESOR Dr. VÍLCHEZ CÁCEDA, HÉCTOR ALEXANDER https://orcid.org/0000-0001-7094-0821 Lima – Perú 2022 v Dedicatoria Este trabajo va dedicado a Dios por darme la oportunidad de seguir creciendo profesionalmente, a mi esposa e hijos, por su apoyo constante y total comprensión a lo largo del desarrollo del presente trabajo de investigación, a mis padres por sus grandes consejos de luchar por lo que uno desea. Arévalo Arévalo, Fredy Agradezco a Dios por bendecir mi camino, de igual manera a mi madre Teófila Hilario Huamán, quien es la luz de mis ojos y es un pilar que me ha estado apoyando en cada momento de mi formación universitaria y que además gracias a sus consejos hoy estoy a punto de comenzar una nueva etapa profesional. Suarez Hilario, Nelson Guillermo vi Agradecimiento Al Dr. Vílchez Cáceda, Héctor Alexander, nuestro asesor de investigación, por guiarnos durante esta etapa de elaboración de tesis y además de fomentarnos el acto de investigar, ya que gracias a ello, hoy dejaremos de ser estudiantes para convertirnos en profesionales de la salud. Arévalo Arévalo, Fredy Suarez Hilario, Nelson Guillermo vii ÍNDICE GENERAL Páginas Resumen viii Abstract ix I. INTRODUCCIÓN 1 II. MATERIALES Y MÉTODOS 6 II.1 Enfoque y diseño de la investigación 6 II.2 Población, muestra y muestreo 6 II.3 Variables de investigación 6 II.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos 7 II.5 Proceso de recolección de datos 7 II.6 Métodos de análisis estadístico 9 II.7 Aspectos éticos 10 III. RESULTADOS 11 IV. DISCUSIÓN 16 IV.1 Discusión de resultados 17 IV.2 Conclusiones 19 IV.3 Recomendaciones 19 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 20 ANEXOS 26 viii Índice de tablas Tabla 1. Resultados del ensayo de solubilidad 11 Tabla 2. Resultados del ensayo fitoquímico 12 Tabla 3. Halos de inhibición de ensayo microbiológico en Salmonella 13 enterica Tabla 4. Estadísticos descriptivos de los resultados del ensayo 14 microbiológico Tabla 5. Comparación de medias por el ANOVA 14 Tabla 6. Comparaciones múltiples por la prueba de Tukey 15 ix Índice de figuras Figura 1. Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) 32 Figura 2. Selección de la muestra de Syzygium aromaticum L. Merr. & 33 L.M. Perry (clavo de olor) Figura 3. Procedimiento de lavado de la muestra de Syzygium 34 aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Figura 4. Procedimiento de secado de la muestra de Syzygium 35 aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Figura 5. Procedimiento de molienda de la muestra de Syzygium 36 aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Figura 6. Preparación del macerado del extracto etanólico de los 37 botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Figura 7. Procedimiento de filtración del macerado del extracto etanólico 38 de los botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Figura 8. Obtención del extracto seco de los botones florales de 40 Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Figura 9. Prueba de solubilidad 41 Figura 10. Marcha fitoquímica 41 Figura 11. Preparación de Medio de Cultivo 42 Figura 12. Activación de la cepa de Salmonella enterica ATCC 51741 43 Figura 13. Inoculación de placas 44 Figura 14. Preparación de discos de sensibilidad 45 Figura 15. Colocación del disco 46 Figura 16. Incubación 46 Figura 17. Lectura de resultados 47 x Índice de anexos Anexo A. Operacionalización de las variables 26 Anexo B. Instrumento de recolección de datos 27 Anexo C. Matriz de consistencia 29 Anexo D. Informe de laboratorio 30 Anexo E. Certificado Taxonómico 31 Anexo F. Evidencias de campo 32 Anexo G. Certificado de análisis de Salmonella Enterica subsp. 47 Enterica Anexo H. Resolución de aprobación de proyecto de tesis 48 xi RESUMEN Objetivo: Evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) sobre Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741. Materiales y métodos: Investigación de tipo experimental, explicativo, prospectivo, transversal. Resultados: Los metabolitos secundarios que se detectaron en la prueba del tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) fueron compuestos fenólicos, alcaloides, lactonas, taninos, antocianinas y flavonoides. Mediante la prueba de ANOVA (p<0,05) y Tukey, se mostró como resultado diferencia estadísticamente significativa entre los grupos experimentales al 5 %, 25 % y 75 % comparado con el control (DMSO) frente a Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741. Conclusión: El extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) presenta actividad antibacteriana frente a cepas de Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741 Palabras clave: Actividad antimicrobiana, Syzygium aromaticum L. y Salmonella enterica xii ABSTRACT Objective: To evaluate the in vitro antibacterial effect of ethanolic extract of flower buds of Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (cloves) on Salmonella enterica subspecies enterica ATCC 51741. Materials and methods: Experimental, explanatory, prospective, cross-sectional research. Results: The secondary metabolites that were detected in the phytochemical screening test of the ethanolic extract of flower buds of Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (cloves) were phenolic compounds, alkaloids, lactones, tannins, anthocyanins and flavonoids. Using the ANOVA test (p<0.05) and Tukey, the result was a statistically significant difference between the experimental groups at 5%, 25% and 75% compared to the control (DMSO) against Salmonella enterica subspecies enterica ATCC 51741. Conclusion: The ethanolic extract of flower buds of Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (cloves) exhibits antibacterial activity against strains of Salmonella enterica subspecies ENTERICA ATCC 51741 Keywords: Antimicrobial activity, Syzygium aromaticum L. and Salmonella enterica. xiii I. INTRODUCCIÓN Las infecciones de origen bacteriano son un problema de salud pública1-3, estas se pueden adquirir mediante el contacto con alimentos y/o agua contaminada, así como por el aire4-6. Algunas de las explicaciones fundamentales detrás de las enfermedades relacionadas con el tracto gastrointestinal son la contaminación de los alimentos por diferentes microorganismos7-8. Dentro de esto se entiende que los brotes de gastroenteritis bacteriana pueden ocurrir cuando se consumen alimentos contaminados9. Un brote también puede desencadenar el retiro de productos agrícolas y otros alimentos, asimismo las bacterias que causan gastroenteritis se transmiten fácilmente de persona a persona si alguien lleva la bacteria en sus manos10-12, en esta circunstancia, estas enfermedades se consideran como problemas graves en la salud pública13. La (OMS) estima que el 70 % de las patologías son contagiadas por los alimentos infectados y ocurren en distintas fases del ciclo de producción, entrega, consumo de alimentos y ocasiona la muerte de alrededor de 525,000 personas anualmente en el mundo14-15, Ahora es probable que otras causas, como las infecciones bacterianas sépticas, representen una proporción cada vez mayor de todas las muertes asociadas a problemas gastrointestinales16. Por lo tanto, las patologías diarreicas son el siguiente motivo de mortalidad en el planeta, influyen en todos los grupos de edad, aunque los jóvenes son los más propensos17. Se determina que la causa por salmonelosis se refiere a cualquier enfermedad causada a los seres humanos por todos los serotipos de Salmonella, excepto por los distintos serotipos tifoideos: Typhi y Paratyphi.18-19 Por lo general se adquiere por vía oral a través de agua o alimentos contaminados. Anualmente, se estima que hay 1,300 millones de casos de gastroenteritis, que provocan aproximadamente 3 millones de muertes en todo el mundo20-21. Los lugares que revelan una tasa baja (menos de 100 casos por cada 100,000 pobladores): Europa, Oceanía y Norteamérica. En los Estados Unidos, en 2013, se contabilizaron hasta 7,277 casos, de los cuales 27 sujetos murieron22-23. En la Unión Europea produjo un descenso de los eventos de salmonelosis en humanos, en los que los serovares hallados Salmonella enteritidis (40 %) y Salmonella typhimurium (30 %), el 83 % de los eventos se iniciaron en la propia localidad; y el 80 % de las enfermedades contraídas durante la marcha se debieron principalmente a visitas a distritos de la masa continental asiática y africana24-25. En ciertos lugares del Perú, se han observado que la ocurrencia de la infección diarreica es de 4,38 casos por infante anualmente26, ocasionando una gran alerta de la epidemiología en la localidad a fin de prevenir la expansión de esta infección27. Por todo lo mencionado en párrafos anteriores se propone investigar las propiedades antibacterianas del extracto etanólico del clavo de olor como una alternativa terapéutica frente a estas infecciones que ocasionan altos índices de mortandad y morbilidad a nivel mundial. Clavo de olor o Syzygium aromaticum, es un capullo de flor seco perteneciente a la familia Myrtaceae que es autóctona de las islas Maluku en Indonesia, pero que recientemente se ha cultivado en diferentes lugares del mundo28. El árbol de clavo de olor está compuesto de hojas y brotes, los cuales se utilizan en diversos ámbitos tales como en la industria cosmética, en el rubro alimentario y en la medicina tradicional debido a sus efectos antioxidante y antimicrobiano; asimismo el clavo de olor posee eugenol que calma el dolor y combatir la infección29-30 Por otro lado, la Salmonella es una clase de bacilos gramnegativos que ocupa un lugar en la familia Enterobacteriaceae y comprende de dos especies, la Salmonella bongori y la Salmonella enterica, según indica el diagrama de White-Kauffmann. La especie Salmonella enterica se compone de seis subespecies, con cerca de 2,659 serovares. De estos, la subespecie enterica es responsable de aproximadamente 1,547 serovares, de los cuales el 99 % ocasiona infecciones en animales y humanos31-32. A continuación, se presentan los siguientes antecedentes: Packyanathan J, et al (2017), compararon las propiedades antibacterianas del aceite de clavo de olor y de eucalipto con las cepas clínicas de estafilococo. El aceite esencial del clavo de olor en los resultados evidenció frente Staphylococcus aureus mostró la susceptibilidad máxima de 21 mm de zona de inhibición y contra 2 Escherichia coli una zona de inhibición de 9 mm, el aceite de clavo evidenció que no mostró ningún efecto contra Escherichia coli33. Gaibor E. (2018), comparó el impacto inhibitorio del extracto etanólico de propóleos versus el aceite extraído del clavo de olor, contra Streptococcus mutans. Se refleja en los resultados que la sustancia de propóleo no tiene actividad inhibitoria frente a Streptococcus mutans en ninguna de sus concentraciones, por el contrario, el aceite de clavo de olor presentó efecto antimicrobiano, medianamente susceptible al 50 % y susceptible al 75 y 100 %34. Pastrana Y, et al (2017), investigaron la actividad antimicrobiana de la canela y clavo de olor frente Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella. En los resultados se observó efecto a concentraciones más elevadas sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus, disponiéndolos como sensibles35. Albines W. (2020), determinó la capacidad antibacteriana de Orégano y Clavo de olor respecto Streptococcus mutans. Se muestra en los resultados que la zona de inhibición de Syzygium aromaticum midió 20,09 mm y el Origanum vulgare un 14,74 mm, presentando una mayor actividad antibacteriana para Syzygium aromaticum36. Rodríguez A. (2018), comprobó la actividad antibacteriana del aceite de clavo de olor, en cultivo de Streptococcus mutans sp. Se evidencia en los resultados que el aceite del clavo de olor indicó efecto antibacteriano sobre Streptococcus mutans sp37. Gonzales L. (2018), estimó el impacto antibacteriano del aceite de clavo de olor contra Staphylococcus aureus en contraste con ciprofloxacino. Syzygium aromaticum evidenció en los resultados actividad antibacteriana frente Staphylococcus aureus, pero inferior con el ciprofloxacino38. La justificación del presente estudio fue aportar a la comunidad con una alternativa terapéutica frente a infecciones del tracto gastrointestinal, asimismo ayudará a prevenir y combatir problemas relacionados a la resistencia bacteriana. El presente estudio tiene como objetivo general: Evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & 3 L.M. Perry (clavo de olor) sobre Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741. El presente trabajo de investigación tiene como hipótesis general: El extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) tiene efecto antibacteriano in vitro sobre Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741. 4 II. MATERIALES Y MÉTODOS II.1 Enfoque y diseño de la investigación Enfoque: Cuantitativo39. Experimental: Debido a que se manipuló la variable independiente para evaluar una relación entre variables de tipo causa-efecto40. Explicativo: porque se especificó una asociación entre las variables propuetas41. Prospectivo: debido a que se recolectó datos del presente42. Transversal: Porque se analizó datos en un tiempo sobre una población o subconjunto predefinido43. II.2. Población, muestra y muestreo Conformada por 5 kilos de botones florales de clavo de olor colectados mediante muestreo no aleatorizado el distrito de Villa el Salvador, provincia de Lima, departamento de Lima a 143 m.s.n.m. con coordenadas 12°13'33.2"S 76°55'45.0"W. La muestra fue de 1 kg de botones florales secos de clavo de olor. El muestreo fue no probabilístico, porque se llevó a cabo siguiendo los criterios de exclusión e inclusión establecidos. II.3 Variables de investigación Variable independiente: Extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) Variable dependiente: Actividad antibacteriana in vitro frente a Salmonella entérica ATCC 51741 II.4 Técnicas e Instrumento de recolección de datos La técnica utilizada fue la observación, la cual se llevó a cabo durante los procedimientos fitoquímicos y microbiologicos43. El instrumento fue una ficha de observación ad hoc en la cual se apuntaron los resultados de cada uno de los ensayos realizados44. 5 II.5 Proceso de recolección de datos En la localidad de Villa el Salvador, departamento de Lima, los botones florales secos colectados mediante muestreo no aleatorizado a una altura de 143 m.s.n.m. y coordenadas de 12°13'33.2"S 76°55'45.0"W., luego fueron llevados al laboratorio Santa Rosa (RUC: 20332125266), para el tratamiento correspondiente, en la determinación taxonómica de la clase vegetal a cargo de un consultor botánico, se envió una muestra. La muestra colectada fue seleccionada a fin de suprimir las que estén deterioradas o en fase de oxidación. A continuación, con una gran cantidad de agua fueron lavadas, en ese punto fueron secadas, y en ese momento se desecaron en una estufa a 40°C durante 48 horas hasta que se obtuvo un ejemplar totalmente seco y fácilmente triturable mediante el raspado con la mano. Así pues, con un mortero se pulverizó hasta conseguir un polvo homogéneo. El elemento obtenido fue almacenado dentro de un recipiente de cristal ámbar fijo y hermético, protegido contra la luz y se agitó cada 12 horas por 5 días. Finalmente se filtró y el extracto fluido libre de marco se llevó a estufa para eliminar el solvente y obtener el extracto seco45. Para la prueba de solubilidad de utilizo 0,5 g del extracto seco junto con 0,5 mL de distintos solventes del tipo Etanol, butanol, metanol, cloroformo, agua destilada, éter de petróleo y diclorometano por los diferentes solventes que pertenecieron a la serie eluotropica46. Para realizar el tamizaje fitoquímico se utilizó 1 mL de extracto fluido en cada uno de los 14 tubos de ensayo, se siguió el método de la Dra. Olga Lock, luego se procedió a iniciar el ensayo fitoquímico utilizando los siguientes reactivos47. Para realizar el tamizaje fitoquímico se utilizó 1 mL de extracto fluido en cada uno de los 14 tubos de ensayo, se siguió el método de la Dra. Olga Lock, luego se procedió a iniciar el ensayo fitoquímico utilizando los siguientes reactivos48. Baljet (Lactonas α, β insaturadas), Dragendorff (Alcaloides), Gelatina-sal (Taninos), Fehling A y B (Azúcares reductores), Benedict 6 (Azúcares reductores), NaOH 10 % (Antocianinas), Cloruro férrico (Compuestos fenólicos), Shinoda (Flavonoides), Liebermann-Burchard (Triterpenos y esteroides), Gelatina (Taninos), Wagner (Alcaloides), Índice Afro simétrico (Saponinas), Borntrager (Quinonas) y Mayer (Alcaloides) Para la elaboración del estándar de 0,5 Mc Farland, se preparó solución de cloruro de bario 0,048 M, así como una solución de ácido sulfúrico 0,18 M, para obtener el estándar se disolverá 0,5 y 95, 5 mL de cloruro de bario 0,048 M y ácido sulfúrico 0,18 M respectivamente; haciendo uso de un espectrofotómetro UV-VIS a 625 nm como último paso, con el fin de hallar el siguiente resultado, 0,08 – 0,10, se validó la turbidez de la suspensión.49 Para la reactivación de S. enterica subespecie. enterica ATCC 51741 liofilizada se disolvió el pellet con la sustancia que el laboratorio fabricante produce del Kwik-Stik. Acto seguido, la solución que contiene la bacteria se empapó con un hisopo, posteriormente el mismo hisopo en el caldo nutritivo esterilizado que estuvo recién elaborado fue homogenizado. Las cepas fueron incubadas a 37 ° C por 24 horas50-53. Usando la proporción requerida de caldo liofilizado para el cultivo de las cepas se empleó 250 mL de agar nutritivo y se disolvió con 250 mL de agua desionizada. Se esterilizó en un equipo autoclave a temperatura de 121° C, por un tiempo de 15 min la solución que resulta. Luego el líquido resultante se vertió en 10 placas Petri estériles y que se dejó hasta que gelifique. Finalmente, se procedió a sumergir en el inoculo para sembrar en las 10 placas petri, mediante el método de estrías múltiples51. Luego se procedió a utilizar discos para los grupos experimentales y para los grupos control. ● Extracto etanólico de clavo de olor al 5 % ● Extracto etanólico de clavo de olor al 25 % ● Extracto etanólico clavo de olor al 75 % ● Control negativo ● Ciprofloxacino de 5 ug 7 La incubación de las placas se llevó a cabo en una estufa bajo las condiciones de 37 °C de 24 a 48 horas, luego de este tiempo se midió el halo de inhibición con el uso del vernier51. II.6 Métodos de análisis estadísticos Los resultados se llevaron a un paquete de Microsoft Excel y luego se procedió a realizar la estadística en (SPSS) versión 27, ANOVA y test de Tukey, se realizó la estadística descriptiva, pruebas de normalidad. II.7 Aspectos éticos Se procedió a utilizar procedimientos de buenas prácticas de laboratorio del Manual de indicaciones del Instituto Nacional de Salud, asimismo el documento cumplió con los requisitos de una investigación original, finalmente los investigadores declararon no tener algún conflicto de interés52. III. RESULTADOS 3.1. Prueba de Solubilidad 8 Tabla 1. Resultados del ensayo de solubilidad TUBO SOLVENTE RESULTADOS N° 1 Éter de petróleo - N° 2 Diclorometano + N° 3 Cloroformo + N° 4 Butanol ++ N° 5 Etanol 96 ++ N° 6 Metanol + N° 7 Agua destilada - N° 8 Dimetil sulfoxido +++ -: Insoluble; +: Poco soluble; ++: Medianamente soluble; +++: Muy soluble El extracto en estudio fue muy soluble en dimetil sulfoxido, medianamente soluble en etanol 96 y butanol y poco soluble en solventes como cloroformo y diclorometano. 3.2. Tamizaje fitoquímico 9 Tabla 2. Ensayo fitoquímico TUBO ENSAYOS METABOLITO RESULTADO N° 1 Borntrager Antraquinonas + N° 2 Cloruro férrico Compuestos fenólicos +++ N° 3 Liebermann-Burchard Terpenos y esteroides ++ N° 4 Dragendorff Alcaloides +++ N° 5 Mayer Alcaloides +++ N° 6 Wagner Alcaloides +++ N° 7 Baljet Lactonas α,β-insaturadas +++ N° 8 Gelatina Taninos +++ N° 9 Gelatina-sal Taninos +++ N° 10 NaOH 10% Antocianinas ++ N° 11 Benedict Azúcares reductores ++ N° 12 Fehling A y B Azúcares reductores +++ N° 13 Espuma Saponinas - N° 14 Shinoda Flavonoides +++ N° 15 Ninhidrina Aminoácidos - (-): Ausencia; (+): Mínima; (++): Mediana (+++): Abundante presencia En la tabla 2 se aprecia que los fitoconstituyentes con abundante presencia fueron alcaloides, taninos, Lactonas α, β-insaturadas, flavonoides y azucares reductores. 3.3. Ensayo microbiológico 10 Tabla 3. Ensayo microbiológico en Salmonella enterica Diámetros de inhibición en mm Microorganismo 75 % 25 % 5 % Ciprofloxacino DMSO 5 ug 12.67 8.86 7.30 35.32 6 12.64 8.82 7.32 35.35 6 12.65 8.85 7.35 35.34 6 Salmonella 12.64 8.86 7.30 35.30 6 enterica 12.65 8.84 7.31 35.32 6 12.67 8.82 7.30 35.30 6 ATCC 12.64 8.80 7.32 35.25 6 51741 12.63 8.84 7.31 35.30 6 12.65 8.80 7.34 35.31 6 12.63 8.86 7.32 35.32 6 Media 12.65 8.84 7.32 35.31 6 Tamaño de discos: 6mm, por lo que al reportarse 6mm es indicativo que no existe formación halo de inhibición. En la tabla 3 se aprecia que el grupo de ciprofloxacino obtuvo un halo de 35,31 mm. Seguido del grupo experimental al 75 % el cual obtuvo un halo de 12, 65 mm. Tabla 4. Estadísticos descriptivos de los resultados del ensayo microbiológico Estadísticos 11 Media 14,0220 Mediana 8,8400 Moda 6,00 Desv. Desviación 10,98541 Varianza 120,679 Salmonella enterica Asimetría 1,393 Error estándar de asimetría ,337 Curtosis ,170 Error estándar de curtosis ,662 Rango 29,35 La tabla 4 muestra las diferentes pruebas realizadas al someter los resultados a la estadística descriptiva. Tabla 5. Comparación de medias por el ANOVA ANOVA Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática Entre 5913,266 4 1478,317 4116599,332 ,000 Salmonella grupos enterica Dentro de ,016 45 ,000grupos Total 5913,282 49 En la tabla 5 el análisis de varianzas (ANOVA) muestra un valor p<0.05, por lo que existe diferencia estadísticamente significativa entre los grupos experimentales. 12 Tabla 6. Comparaciones múltiples por la prueba de Tukey Diferencia de Desv. Intervalo de confianza al 95 % (I) Grupo (J) Grupo Sig. medias (I-J) Error Límite inferior Límite superior DMSO 29,31100* ,00847 ,000 29,2869 29,3351 5 % 27,99400* ,00847 ,000 27,9699 28,0181 Ciprofloxacino 5 ug 25 % 26,47600* ,00847 ,000 26,4519 26,5001 75 % 22,66400* ,00847 ,000 22,6399 22,6881 Salmonella Ciprofloxacino 5 ug -29,31100* ,00847 ,000 -29,3351 -29,2869 enterica 5 % -1,31700* ,00847 ,000 -1,3411 -1,2929 DMSO 25 % -2,83500* ,00847 ,000 -2,8591 -2,8109 75 % -6,64700* ,00847 ,000 -6,6711 -6,6229 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. La tabla 7 el estadístico de Tukey muestra que los valores de significancia asintótica bilateral son p<0.05 en las comparaciones entre los grupos al 5 %, 25 % y 75 % frente a Ciprofloxacino 5 ug, así como al control DMSO. IV. DISCUSIÓN IV.1 Discusiones En la prueba de solubilidad, los resultados evidenciaron que el extracto fue mayormente soluble en solventes de naturaleza polar, esto se debe a la interacción de los grupos hidroxilo del alcohol y los hidrógenos del agua para formar puentes de hidrogeno; y en cuanto al ensayo fitoquímico, la presencia de los metabolitos secundarios identificados de manera cualitativa es un indicio que estos sean los probables responsables de su efecto antibacteriano. Los resultados del estudio respecto a la composición fitoquímica difieren con el estudio realizado por Batiha G et al (2020) quienes determinaron a través del análisis de cromatografía de gases-espectroscopia de masas (GC-MS) la existencia de 36 componentes en el aceite esencial de clavo, que se aisló por hidrodestilación, incluidos eugenol, β-cariofileno, eugeniacetato, hexanoato de etilo, 2-heptanona, α-humuleno, calacoreno, humulenol , y calamen-eno y varias moléculas como el kaempferol, biflorina, 5, 7-dihidroxi-2-metilcromona-8-C-β-D- glucopiranósido, glucósido de ácido orselínico, miricetina, ramnocitrina, ácido gálico, ácido oleanólico, ácido elágico y triglicósidos flavonoides han sido documentados por su eficacia en la inhibición de bacterias y hongos33. Esta diferencia se debe a que el estudio de Batiha fue por medio de análisis instrumentales y usando una muestra de tipo aceite esencial a diferencia del presente estudio que fue realizado por medio de un análisis de coloración y precipitación, el cual fue con un extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. De igual importancia, Mohammed et al (2020) en su estudio sobre la composición química del aceite esencial de Syzygium aromaticum a través del análisis instrumental, identificaron α-pineno, β-pineno, Δ3-careno, 2-heptanona, limoneno, 1.8-Cineol, Cis-β-ocimeno, Trans-β-ocimeno, Acetato de 2-heptilo, 2-metil-6- metilen-1,7-octadien-3-ona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2-nonanona, α-cubebeno, α- copaeno, β-bourboneno, linalol, ε-cadineno, 2-Undecanono, Terpineno-4-ol, β- cariofileno, Benzoato de metilo, Pulegona, acetofenona, zonarena, Benzoato de etilo, Acetato de, dihidrocarvyle, α-humuleno, γ-Muurolene, α-terpineol, Acetato de terpenilo, Germacreno D, Isómero de cubeneno, Acetato de bencilo, α-muuroleno, α-selineno, carvona, α-farneseno, δ-cadineno, γ-cadineno, Alcool terpenique, Salicilato de metilo, Cadina-1.4-dieno, α-amorfeno, Calamenene, Oxido de isocariofileno, Oxido de Cariofileno, Metileugenol, Epoxi-6.7-humuleno, Cariofilenol, cubenol, sesquiterpenol, eugenol, α-Cadinol, Acetato de eugenio, Epóxido sesquiterpenique, Caryophylla-3.7-dien-6-ol, Epóxido sesquiterpenique, isoeugenol, Epóxido sesquiterpenique y 2. 3. 4-trimetoxiacetofenona en diferentes proporciones, el cual indican que la variedad de su composición guarda relación con la actividad antimicrobiana del Syzygium aromaticum34. Por lo tanto, investigaciones anteriores han demostrado que la composición química del aceite esencial de Syzygium aromaticum puede verse influenciada por la condición del medio ambiente, el genotipo, el origen geográfico, el período de cosecha, el lugar de secado, la temperatura y la duración del secado y el método de extracción. Con respecto al ensayo microbiológico in vitro se evidenció que la concentración al 75 % genero el mayor halo de inhibición además de presentar la característica de sensible según la escala de Duraffourd. Los resultados del ensayo microbiológico son semejantes a los obtenidos por Packyanathan J, et al (2017), quienes compararon las propiedades antibacterianas del aceite de clavo de olor y de eucalipto frente a estafilococo y Escherichia coli, evidenciando la inhibición del crecimiento del Staphylococcus aureus, sin embargo, no presentó ningún efecto contra Escherichia coli13. Esta propiedad se atribuye al eugenol, los ácidos oleicos y los lípidos que se encuentran en los aceites esenciales. Por otro lado, el presente estudio difiere de Pastrana Y, et al (2017), quienes, al evaluar la capacidad antibacteriana del extracto de canela y clavo de olor, no obtuvieron resultados óptimos frente a cepas de Salmonella sp, pero si frente a otras cepas bacterianas utilizado concentraciones más elevadas, esto se podría explicar a que el aceite de esencial de canela contiene una alta concentración de trans-cinamaldehído, el cual es un componente antibacteriano que actúa inhibiendo las amilasas y proteasas lo que altera la síntesis de parad celular procariota15. 15 Como último estudio con resultados similares se encuentra el realizado por Gonzales L. (2018), quien estimó el impacto antibacteriano del aceite de clavo de olor contra Staphylococcus aureus. evidenciando en los resultados actividad antibacteriana frente a esta bacteria, pero inferior al ciprofloxacino. El posible mecanismo de acción del eugenol es la inhibición de la ATPasa, provocando la desnaturalización de proteínas lo que finalmente alteraría su estructura celular18. 16 IV.2 Conclusiones 1. El extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) presenta actividad antibacteriana frente a cepas de Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741 2. Los metabolitos secundarios identificados en el extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) fueron compuestos fenólicos, alcaloides, lactonas, taninos, antocianinas y flavonoides. 3. Las concentraciones del extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) al 5 %, 25 % y 75 % poseen efecto antibacteriano in vitro frente a Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741 4. Las concentraciones del extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) al 5 %, 25 % y 75 % no tuvieron mayor efecto antibacteriano en comparación con Ciprofloxacino 5ug. IV.3 Recomendaciones § Realizar investigaciones del mismo rubro en donde se incluya otro tipo de bacterias tanto gramnegativas como grampositivas. § Continuar con el estudio, pero esta vez con estudios en animales de experimentación (in vivo). § Analizar la capacidad antibacteriana de otra droga vegetal perteneciente a la misma especie vegetal. § Realizar estudios in vitro con la misma especie vegetal, pero en sinergismo con antibióticos comerciales. 17 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Heggenhougen H. Bacterial Infections: Overview. In: Enciclopedia internacional de salud pública. 2008. p. 273–82. 2. Tanner J, Kingsley R. Evolution of Salmonella within Hosts. Trends Microbiol. 2018;26(12):986–98. 3. Parra M, Durango J, Máttar S. microbiología, patogénesis, epidemiología, clínica y diagnóstico de las infecciones producidas por salmonella. 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Operacionalización de las variables VARIABLES DEFINICIÓN DEFINICIÓN ESCALA N° DE CONCEPTUAL OPERACIONAL DIMENSIONES INDICADORES DE VALORMEDICIÓN ÍTEMS Es una mezcla y se obtiene VARIABLE macerando la Pruebas de INDEPENDIENTE planta Se procederá solubilidad (-) Ausente Extracto etanólico de aromática en con el análisis Fitoquímica Identificación (+) Escaso botones florales de etanol (alcohol fitoquímico en la de metabolitos (++) Leve Syzygium etílico), por lo determinación secundarios Ordinal 14 (+++) aromaticum L. Merr. que sólo se de metabolitos Concentraciones Reacciones Moderado & L.M. Perry (clavo extrae los primarios y químicas de (++++) de olor) compuestos secundarios precipitación y Abundante solubles en coloración este solvente Se inocularán Capacidad que placas petri con 6 mm: nulo VARIABLE presenta un la cepa 8 – 14 mm: DEPENDIENTES compuesto Salmonella Medición de Sensibilidad Actividad para inhibir el entérica Microbiológico diámetro límite antibacteriana sobre aumento de subespecie inhibición (mm) Razón 10 14 – 20 mm: Salmonella entérica una población entérica ATCC al 5%, 25% y Medio subespecie entérica bacteriana o 51741 y se 75% >20 mm: ATCC 51741 para eliminarla expondrán las Muysustancias sensible experimentales. ANEXO B. Instrumentos de recolección de datos Tabla A: recolección de datos del efecto antibacteriano del extracto etanólico CEPAS Salmonella entérica subespecie entérica ATCC 51741 Concentración Halos de inhibición (mm) del extracto hidroalcohólico N X (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 75 25 5 n: número de ensayos microbiológicos X: promedio Tabla B: Marcha fitoquímica del extracto etanólico IDENTIFICACION DE METABOLITOS SECUNDARIOS Metabolitos Reactivos Resultado secundarios Quinonas Borntrager Compuestos fenólicos FeCl3 Flavonoides Shinoda Antocianinas NaOH 10% Taninos Gelatina Taninos Gelatina Sal Alcaloides Dragendorff Alcaloides Wagner Alcaloides Mayer Triterpenos y Esteroides Liebermann Burchard Lactonas α, β insaturadas Baljet Azucares Reductores Benedict Azucares Reductores Fehling Saponinas Espuma Donde: (-) Ausente (+) Escaso (++) Leve (+++) Moderado (++++) Abundante 26 ANEXO C. Matriz de consistencia EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE BOTONES FLORALES DE Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) SOBRE Salmonella enterica subespecie enterica ATCC 51741 Formulación del problema Objetivos Hipótesis Problema General Objetivo General Hipótesis General ¿Cuál es el efecto antibacteriano in vitro del Evaluar el efecto antibacteriano in vitro del El extracto etanólico de botones florales de extracto etanólico de botones florales de extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) tiene efecto antibacteriano in (clavo de olor) sobre Salmonella enterica? (clavo de olor) sobre Salmonella enterica vitro sobre Salmonella enterica Problemas Específicos Objetivos Específicos Hipótesis Específicas ¿Qué metabolitos secundarios tiene el extracto Detectar los metabolitos secundarios El extracto etanólico de botones florales de etanólico de botones florales de Syzygium presentes en el extracto etanólico de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de botones florales de Syzygium aromaticum L. (clavo de olor) tiene metabolitos secundarios olor) responsables del efecto antibacteriano in Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) responsables del efecto antibacteriano in vitro? responsables del efecto antibacteriano in vitro. vitro mediante análisis fitoquímico cualitativo ¿Cuál es la concentración del extracto Precisar la concentración del extracto Existe una concentración del extracto etanólico de botones florales de Syzygium etanólico de botones florales de Syzygium etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) que posee efecto antibacteriano in vitro olor) que posee efecto antibacteriano in vitro olor) que posee efecto antibacteriano in vitro sobre Salmonella enterica ATCC 51741? sobre Salmonella entérica ATCC 51741 sobre Salmonella entérica ATCC 51741 ¿Cuál es el efecto antibacteriano in vitro del Comparar el efecto antibacteriano in vitro del El extracto etanólico de botones florales de extracto etanólico de botones florales de extracto etanólico de botones florales de Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry Syzygium aromaticum L. Merr. & L.M. Perry (clavo de olor) tiene efecto antibacteriano in (clavo de olor) en comparación con (clavo de olor) con ciprofloxacino 5 ug sobre vitro en comparación con ciprofloxacino 5 ug ciprofloxacino 5 ug sobre Salmonella enterica Salmonella entérica ATCC 51741 sobre Salmonella entérica ATCC 51741 ATCC 51741? ANEXO D. Informe de laboratorio 30 ANEXO E. Certificado Taxonómico 31 ANEXO F. Evidencias de campo INFORME DE PROCESAMIENTO DE MUESTRA Muestra: · Botones florales de Syzygium aromaticum (clavo de olor) 1. Recepción de muestra · Fecha : 11-12-21 · Cantidad recibida : 1000 g 2. Tratamiento y extracción de la droga vegetal 2.1 Tratamiento de la droga vegetal Con el fin de adecuar la muestra para el posterior proceso de preparación del extracto alcohólico, se realizaron las siguientes operaciones previas: a. Selección y Limpieza Se eliminó cuidadosamente la tierra que pudiera estar adherida sobre la superficie de los botones florales, así como aquellos que estuvieran en mal estado o con signos de contaminación microbiana o por insectos. · Cantidad de muestra : 1000 g · Cantidad muestra selecta : 969.3 g · Cantidad de residuos: : 30.7 g 32 Botones florales en buen estado Botones florales deteriorados Total de botones florales seleccionados 33 b. Lavado Con este proceso se eliminó todos los vestigios de tierra que pudieran haber quedado sobre los botones florales aplicando un flujo continuo de agua potable a temperatura ambiente, se enjuagó con agua destilada y se dejó a escurrir. Lavado con agua Enjuague con agua destilada Escurrido 34 c. Secado Este proceso consiste en eliminar gran parte del agua de la especie. Esto debido a que la presencia de agua es el principal responsable de la alteración de la muestra recolectada. Al descender la cantidad de agua, las enzimas detienen su actividad, quedan inhibidas y la muestra se conserva. Así mismo facilita el proceso de extracción. En este caso la muestra fue distribuida sobre bandejas de papel kraft y secada por 48 horas empleando una estufa con aire recirculante a una temperatura de 40 °C. · Tiempo de secado: 48 horas · Temperatura de secado: 40 °C · Peso obtenido luego de proceso: 900. 2 g Botones florales sobre bandejas de papel kraft Estufa a 40 °C d. Molienda La muestra una vez seca, fue sometida a trituración mecánica empleando un mortero y pilón de porcelana, con la finalidad de reducir el tamaño de partículas y aumentar el número de las mismas para de esta manera hacer más eficiente el proceso de extracción al incrementar la superficie de contacto. · Peso obtenido luego de molienda: 897.2 g 35 Proceso de molienda 36 2.2 Extracción a. Macerado El proceso de extracción se realizó macerando, dentro de un frasco ámbar, el material obtenido luego de la molienda con etanol de 96°. El proceso de maceración se realizó durante 5 días, sometiéndolo a agitación mecánica cada 12 horas. · Cantidad de muestra a macerar: 400 g · Solvente: etanol 96° · Cantidad de solvente: 700 mL · Días de macerado: 5 días Proceso de maceración 37 b. Filtrado El líquido resultante del proceso de maceración fue filtrado empleando papel de filtro w hatman N°1 y un embudo de vidrio. · Cantidad liquido filtrado: 640 ml Proceso de filtración 38 c. Obtención extracto seco Para facilitar la evaporación del disolvente, el líquido filtrado fue vertido sobre placas petri de vidrio y fue llevado a estufa de aire recirculante a una temperatura de 40°C hasta sequedad. · Cantidad líquido a secar: 640 ml · Temperatura: 40°C · Tiempo de secado: 48 horas · Cantidad extracto obtenido: 28.5 g 39 Proceso de obtención de extracto seco 40 d. Prueba de solubilidad e. Marcha fitoquímica 41 INFORME ENSAYO MICROBIOLÓGICO I. MÉTODO Método: Difusión en disco - Kirby Bauer Consiste en depositar sobre la superficie de una placa de petri con agar previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con diferentes sustancias antibióticas. 1. Preparación de Medio de Cultivo 1.1 Agar Mueller Hinton El medio de cultivo fue preparado partiendo de la base deshidratada y siguiendo las indicaciones proporcionadas por el fabricante. a. Se pesó 7.6 de Agar Mueller Hinton deshidratado y se adicionó 200 ml de agua destilada, posteriormente se procedió a calentar con agitación constante hasta lograr la disolución total del medio de cultivo, por último, se esterilizó empleando un autoclave sometiendo al medio de cultivo a 15 libras de presión (121°C) durante 15 minutos. b. Una vez finalizado el proceso en el autoclave se dejó enfriar hasta que el medio de cultivo alcanzó una temperatura entre 45°C – 50°C y se distribuyó en placas petri estériles de 90 x 15 mm. 42 2. Activación de la cepa : Kwik-stik microbiologics - Salmonella enterica ATCC 51741 Para preparar el inóculo se empleó el producto Kwik-stik microbiologics® que contiene a las cepas de Salmonella enterica en un pelet. a. El Kwik-stik tiene en la parte superior una ampolla con líquido hidratante, el cual fue liberado al presionar una sola vez la mencionada ampolla que se encuentra en la tapa. Luego de realizar esta operación el Kwik-stik se mantuvo en posición vertical para facilitar el flujo del líquido por el mango hasta la parte inferior de la unidad, que contiene el gránulo. b. Por último, se oprime la parte inferior de la unidad para lograr una suspensión homogénea. c. De inmediato se procedió a saturar el hisopo, que contiene el producto, con el material hidratado y se transfirió a una placa con agar TSA, la cual fue incubada a a 37°C durante 24 horas. 3. Método de preparación del inóculo a. Se realizó la suspensión directa, en solución salina (cloruro de sodio 0.9%), de colonias obtenidas de la placa anteriormente incubada durante 24 horas. Salmonella enterica ATCC 51741 Sa b. La turbidez resultante fue inmediatamente ajustada comparándola de manera visual con la turbidez del estándar 0.5 de Mc. Farland. 43 4. Inoculación de placas · Dentro de los 15 minutos posteriores al ajuste de la turbidez del inóculo, se procedió a sumergir un hisopo estéril en la suspensión obtenida; el hisopo se rotó varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo y por encima del nivel del líquido, esto con la finalidad de remover el exceso de inóculo. · Posteriormente se inoculó sobre la superficie seca del agar Muller Hinton, para esto se realizaron estrías en tres direcciones diferentes rotando la placa 60° cada vez, esto con la finalidad de asegurar una distribución uniforme del inóculo. · Previamente todas las placas fueron marcadas para posteriormente colocar los discos. Agar Mueller Hinton Rotulado de placas 44 Siembra en placas con S. enterica 5. Preparación de discos de sensibilidad Para la preparación de los discos se emplearon discos de papel whatman N° 1 de 6 mm de diámetro previamente estériles. Cada uno de los discos fue embebido con 10 uL de muestra de la siguiente manera: · Discos embebidos con extracto de botones florales de Syzygium aromaticum al 75% · Discos embebidos con extracto de botones florales de Syzygium aromaticum al 25% · Discos embebidos con extracto de botones florales de Syzygium aromaticum al 5% · Discos embebidos con DMSO · Discos de ciprofloxacino 5 ug 45 Posteriormente los discos fueron puestos sobre la superficie del medio de cultivo sólido previamente inoculado con las cepas de S. entérica. Colocando discos previamente Placas con S. entérica con preparados discos 6. Incubación Las placas se incubaron durante 24 horas en posición invertida a 37°C dentro de los 15 minutos siguientes a la aplicación de los discos. 46 7. Lectura de resultados Halos de inhibición de los 5 grupos fueron medidos empleando un vernier. 47 ANEXO G. Certificado de análisis de Salmonella Enterica subsp. Enterica 48 49 ANEXO H. Resolución de aprobación del proyecto de tesis 50