FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EFECTO ANTIFÚNGICO in vitro DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LA CORTEZA DE Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) FRENTE A Candida albicans ATCC 10231 TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES Bach. LLAMO PAQUIRACHIN, YENIFER YOANA https://orcid.org/0000-0002-4895-225X Bach. DEL CARPIO PACO, PETER JEAN CLAUDE https://orcid.org/0000-0001-5662-5059 ASESOR Mg. FLORES LÓPEZ, OSCAR https://orcid.org/0000-0001-9091-2537 LIMA – PERÚ 2022 DEDICATORIA A nuestros padres por habernos forjado como las personas que somos actualmente, la mayoría de nuestros logros se los debemos a ustedes. A nuestros familiares, seres queridos y a todas las personas que estuvieron a nuestro lado y aportaron para poder estar donde hoy estamos. Los autores 2 AGRADECIMIENTO Familia, amigos y personas especiales en nuestra vida. Este nuevo logro es en gran parte gracias a ustedes; hemos logrado concluir con éxito este proyecto que en un principio podría parecer una tarea interminable, pero que con esfuerzo y dedicación se logró. Y a nuestro Dios padre por permitirnos haber llegado hasta este momento de nuestras vidas. Muchas gracias a aquellos seres queridos que siempre aguardo en mi alma. Quisiéramos dedicar ésta tesis a ustedes. Los autores 3 ÍNDICE GENERAL Páginas ÍNDICE GENERAL 4 RESUMEN 8 ABSTRACT 9 I. 10II. 152.1. Enfoque y diseño de la investigación: 16 2.2. Población, muestra y muestreo: 16 2.3. Variables de la investigación: 17 2.4. Técnicas de instrumentos y de recolección de datos: 17 2.5. Plan metodológico de la recolección de datos: 17 III. 19IV. 224.1. Discusión 23 4.2. Conclusiones 24 4.3. Recomendaciones 25 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 26 4 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Análisis estadístico descriptivo para los datos recolectados de los halos de inhibición promedio 29 Tabla 2. Análisis comparativo de las medias de cada grupo mediante ANOVA 21 Tabla 3. Análisis de las medias de los halos de inhibición mediante la prueba de Tukey por sub grupos homogéneos 21 Tabla 4. Sensibilidad antibacteriana según la escala de Duraffourd 22 Tabla 5. Determinación de la distribución normal de los datos recolectados 35 Tabla 6. Prueba de homogeneidad de varianzas (Levene) 36 5 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Recolección de la muestra 40 Figura 2. Aplicando criterios de selección en la muestra 41 Figura 3. Lavado y secado de la muestra 41 Figura 4. Pulverizado de la muestra 42 Figura 5. Procedimiento de maceración 43 Figura 6. Filtrado del macerado obtenido 44 Figura 7. Preparación de los extractos de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) 45 Figura 8. Activación de la cepa de Candida alibcans ATCC ATCC 10231 46 Figura 9. Preparación del inóculo - Escala de McFarland 47 Figura 10. Sembrado del inóculo 48 Figura 11. Acondicionamiento de los pocitos en cultivos en agar 49 Figura 12. Aplicación de los extractos 49 Figura 13. Formación de los halos de inhibición 51 Figura: 14. Medición de los halos de inhibición 51 6 ÍNDICE DE ANEXOS Anexo A. Instrumentos de recolección de datos 30 Anexo B. Matriz de consistencia 31 Anexo C. Operacionalización de las variables 33 Anexo D. Análisis estadístico paramétrico de los datos recolectados 34 Anexo E. Certificado de Candida albicans ATCC 10231 37 Anexo F. Identificación taxonómica de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) 39 Anexo G. Evidencias de la parte experimental de la investigación 40 7 RESUMEN Objetivo: Demostrar el efecto antifúngico in vitro del extracto hidroalcoholico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Cándida albicans ATCC 10231. Material y Método: La investigación es de tipo cuantitativo, de tipo prospectivo, transversal con diseño experimental, la población de estudio estuvo conformada por Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) obtenida del distrito de Tarapoto, provincia y departamento de San Martín, ubicado a una altitud de 400,7 m.s.n.m.; se tomó una muestra de 2 kilos de corteza de la muestra vegetal; el extracto se preparó a las concentraciones de 50, 75 y 100% mediante maceración en frio, para la determinación del efecto antifúngico frente a Candida albicans ATCC 10231 se empleó la técnica de difusión en pozo. Resultados: Los resultados encontrados con respecto al tamaño del halo de inhibición fueron de 16,47 + 0,44mm IC: 16,22 -16,71 para el extracto de capirona al 100%; de 11,05 + 0,25mm IC: 10,91 -11,19 para el extracto de capirona al 75%; de 9,11 + 0,43mm IC: 5,75 -6,20 para el extracto de capirona al 50%; los grupos control obtuvieron halos de 5,98 + 0,41mm IC: 5,75 - 6,20 para el control negativo y para el control positivo fue de 26,66 + 0,40mm IC: 26,44 - 26,88. Según la escala de Durafourd Cándida albicans ATCC 10231 es Sensible a los extractos de capirona al 50% y 75%; es muy sensible al extracto de capirona al 100%; es altamente sensible a la nistatina y presenta sensibilidad nula al control negativo. Conclusiones: El extracto hidroalcoholico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) presenta efecto antifúngico in vitro frente a Cándida albicans ATCC 10231 . Palabras clave: Calycophyllum spruceanum Benth; capirona; Cándida albicans; extracto; corteza. 8 ABSTRACT Objective: To demonstrate the in vitro antifungal effect of the hydroalcoholic extract of the bark of Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) against Candida albicans ATCC 10231. Material and Method: The research is quantitative, prospective, cross-sectional with an experimental design, the study population was made up of Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) obtained from the district of Tarapoto, province and department of San Martín, located at an altitude 400.7 meters above sea level; a sample of 2 kilos of bark was taken from the vegetable sample; the extract was prepared at concentrations of 50, 75 and 100% by cold maceration, to determine the antifungal effect against Candida albicans, the well diffusion technique was used. Results: The results found regarding the size of the inhibition halo were 16.47 + 0.44mm CI: 16.22 -16.71 for the 100% capirona extract; 11.05 + 0.25mm CI: 10.91 - 11.19 for capirone extract at 75%; 9.11 + 0.43mm CI: 5.75 -6.20 for capirone extract at 50%; the control groups obtained halos of 5.98 + 0.41mm CI: 5.75 - 6.20 for the negative control and for the positive control it was 26.66 + 0.40mm CI: 26.44 - 26.88. According to the Durafourd scale, Candida albicans ATCC 10231 is sensitive to capirona extracts at 50% and 75%; it is very sensitive to 100% capirone extract; it is highly sensitive to nystatin and has no sensitivity to the negative control. Conclusions: The hydroalcoholic extract of the bark of Calycophyllum spruceanum Benth (capirone) has an in vitro antifungal effect against Candida albicans ATCC 10231. Keywords: Calycophyllum spruceanum Benth; capirona; Candida albicans; extract; Cortex. 9 I. INTRODUCCIÓN En la actualidad existe una problemática a nivel mundial, pues nos referimos a la presencia de una resistencia frente a antifúngicos específicamente frente a Cándida albicans la cual siendo una célula eucariota es capaz de mutar provocando así la ineficacia a algunos antifúngicos1. Candida albicans es un dermatofito frecuente de nuestra flora cutánea, afectando órganos internos como la boca y vagina, actúa como hongo oportunista, manifestándose cuando el sistema inmunitario está disminuido2. Tal dermatofito presenta diferentes factores predisponentes, los mismos que favorecen a su desarrollo, así como su prevalencia en el huésped, C. albicans es la responsable de una de las causas principales de infecciones tanto cutáneas o superficiales, así como infecciones sistémicas, llegando ser calificadas como potencialmente mortales. Se dice que tiene una gran incidencia en cuanto a mortalidad según estudios realizados la tasa de mortalidad se encuentra entre 30% a 50 % según el estado en que se encuentre la persona siendo mucho más mortales aquellos pacientes con presencia de VIH o se encuentren inmunodeprimidos3. C. albicans se encuentra dispersa en todo el mundo, estudios realizados en EE.UU presento resultados afirmando que es una de las causas más comunes de IS adquiridas a nivel nosocomial llegando a presentar tasas brutas de mortalidad de hasta 50%4. “En Brasil, un estudio de vigilancia en 16 hospitales (2007-2010), se encontró Candida en 249 casos de cada 1000 admisiones hospitalarias, con una mortalidad bruta del 72 % (53 % para pacientes que no estaban en la UCI y 85 % para pacientes que estaban en UCI)”5. En el Perú existen algunos estudios acerca de C. albicans y su prevalencia, uno de ellos se realizó en el hospital nacional de alta 10 complejidad de Lima (2004-2006) afirmando en un estudio mediante hemocultivo que un 11,6% de pacientes en UCI presentan Cándida. Existe otro estudio que se realizó en tres hospitales de Lima y Callao (2013 al 2015) donde se reportaron 158 aislamientos y una recurrencia de candidiasis sistémica que fluctúa entre 1 y 2,6 casos por cada 1000 ingresos5. Asimismo, en Lambayeque algunos estudios han reportado la presencia de infecciones por Candida albicans en varias poblaciones, por ejemplo un 15% de infecciones en trabajadoras sexuales (según el MINSA 2001, Programa de control de enfermedades de transmisión sexual y SIDA – PROCETSS), un 6.52% en mujeres que pertenecen al centro penitenciario de Picsi, un 48.14% en pobladoras gestantes de la ciudad de Chiclayo, 2% en trabajadoras sexuales de José Olaya - Chiclayo (DISA Lambayeque, 2000) y un 38.10% en mujeres del grupo etario fértil6. En los últimos tiempos se ha visto un incremento descontrolado en cuanto al uso de antifúngicos esto generando el uso irresponsable de diversos fármacos que muchas veces causan daño en el organismo, o su valor es elevado como consecuencia de la baja economía que existen en muchas zonas del país. Por ende, es necesario se busquen y estudien nuevas alternativas naturales al alcance de todos nosotros. El desarrollo del proyecto de investigación permitirá contribuir con el conocimiento y aplicación de la especie Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) y su propiedad antimicótica frente a un dermatofito muy conocido como C. albicans. Callycophyllum spruceanum Benth (capirona), pertenece a la familia de las Rubiáceas, se distribuye por zonas tropicales, templadas. Los marcadores quimiotaxonómicos de la familia Rubiaceae son: alcaloides indólicos, iridoides y antraquinonas. Los alcaloides indólicos han sido los metabolitos secundarios más estudiados con el fin de comprobar la quimiotaxonomía de la familia. En Callycophyllum spruceanum Benth (capirona) Se identificaron cinco metabolitos secundarios en el extracto, a 11 saber, gardenósido, 5-hidroximorina, cianidina, taxifolina y 5-hidroxi-6- metoxicumarina-7-glucósido7. Por otro lado, Candida albicans es un hongo que se encuentra en la microflora natural y necesita de factores dependientes del huésped para poder desencadenar su patogenicidad de dicho dermatofito. Las especies de Candida se encuentran entre las causas más comunes de enfermedad micótica invasiva, y Candida albicans reina como la principal causa de candidiasis invasiva. Dado que los hongos son eucariotas como su huésped humano, la cantidad de objetivos moleculares únicos que pueden explotarse para el desarrollo de antifúngicos sigue siendo limitada8. Su patogenicidad se debe a la presencia de glicoproteínas las que son capaces de adherirse a la superficie de las células epiteliales para posteriormente formar una especie de tubos germinales los que van a penetrar las células y formar una serie de enzimas las que van a contribuir con la fijación de dicho dermatofito9 Entre los antecedentes internacionales tenemos a Dookie R. et al (2021), quienes definieron por objetivo realizar la caracterización fitoquímica, así como la evaluación antimicrobiana de los extractos metanólicos y etanólicos a partir de la corteza de Calycophyllum spruceanum. Mediante el uso del equipo cromatógrafo de gases se identificó compuestos como iridoides, terpenos, alcaloides y fenoides. El extracto metanólico presentó mayor potencial antimicrobiano contra las cepas A. baumannii, P. aeruginosa, S. enteritidis y S. aureus en concentraciones a partir de 500µ/ml10. Souza A. et al (2018), publicaron su investigación, en la cual realizaron un cribado fitoquímico y evaluaron la acción antioxidante de las especies Lafoensia pacari y Calycophyllum spruceanum formuladas en extractos con etanol y extractos con agua. Los compuestos fitoquímicos encontrados de la especie C. spruceanum son ácidos orgánicos, 12 glucósidos cardioactivos, saponinas y alcaloides. La acción antioxidante fue mayor para el extracto de la especie Lafoensia pacari muy similar a la vitamina C y el extracto de C. spruceanum no presentó una buena acción antioxidante11. Magrini V, Fernández A, Fraige K, Siqueira D, Bolzani V (2016), en su estudio cuyo objetivo fue realizar el estudio fitoquímico de extractos de hojas, ramas y corteza de tallo de Calycophyllum spruceanum Benth (Rubiaceae), se obtuvieron extractos con solventes de diferente polaridad (hexánico, acetato de etilo, metanólico, hidroalcohólico (70:30EtOH:H2O v/v) y acuoso (por extracción por decocción) y fueron analizados, donde se logró identificar compuestos fenólicos que pueden actuar como antioxidantes y antifúngicos potencialmente activos12. Con respecto a los antecedentes nacionales del estudio, tenemos la publicación de los autores Colque, L y Arias L. (2021). Elaboraron su estudio con el propósito de evaluar la sensibilidad in vitro de Candida albicans cuando es expuesta en un extracto hidroalcohólico de la corteza de la especie Calycophyllum spruceanum (Benth). A través de la técnica de difusión en disco el extracto hidroalcoholico de C.spruceanum formó un halo de 16.6mm al 50%, de 13.4mm al 28% y 10.6mm al 14% contra Candida albicans in vitro, comprobando que si tiene actividad contra dicho hongo siendo el efecto mayor en la concentración del 50%13. Gamboa M. y Miranda E. (2020), evaluó la actividad cicatrizante, análisis fitoquímico y su toxicidad en la piel (dermis) de la planta Calycophyllum spruceanum (Benth) formulados en extracto etanólico a partir de su corteza en ratas. Se prepararon tres geles con la especie vegetal en concentraciones de 1%, 2% y 4%, siendo más eficaz en la concentración del 1% con una eficacia de cicatrización del 90%, además, ninguna rata presento toxicidad en la piel al administrarlo tópicamente. Los metabolitos encontrados azucares reductores, flavonoides, taninos y compuestos fenólicos14. 13 Roca M. (2019) cuyo objetivo fue determinar la actividad bactericida y fungicida de los extractos acuosos, etanólicos y metanólicos de las hojas y corteza de capirona (Calycophyllum spruceanum Benth). Los resultados mostraron que los extractos de corteza tuvieron mayor efecto que los de las hojas. Los extractos etanolicos de corteza de 50 y 100 mg/mL presentaron mayor efecto antibacteriano con excepción de los extractos con metanol que si inhibieron a C. albicans a partir de 250 mg/mL. Los extractos metanólicos de hoja y corteza presentaron poca actividad antifúngica15. El objetivo general del presente estudio es demostrar el efecto antifúngico in vitro del extracto hidroalcoholico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Cándida albicans ATCC 10231; Así mismo, la hipótesis general del estudio el extracto hidroalcoholico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) presenta efecto antifúngico in vitro del frente a Cándida albicans. 14 II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Enfoque y diseño de la investigación: El enfoque de la investigación es de tipo cuantitativo, debido a que las variables del estudio son numéricas y fueron analizadas mediante análisis estadístico16. El diseño corresponde al experimental porque existe una influencia y manipulación con respecto a las variables que presentan los investigadores17. El tipo de estudio es prospectivo, transversal, la recolección de los datos se realiza en un tiempo futuro; así mismo, el análisis de estos se efectuó en un determinado momento18. 2.2. Población, muestra y muestreo: Población vegetal: La población estuvo representada por 8 kilogramos de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) del distrito de Tarapoto, provincia y departamento de San Martín, ubicado a una altitud de 404,5 m.s.n.m. Muestra vegetal: La muestra empleada fue de 2 kilogramos de corteza del árbol Calycophyllum spruceanum Benth (capirona)19. El tipo de muestreo empleado en la recolección de los datos fue no probabilístico por conveniencia20. Población biológica: Candida albicans ATCC 10231 Muestra biológica: 15 placas con cultivos de Candida albicans ATCC 10231 2.3. Variables de la investigación: Variable independiente: Extracto hidroalcohólico de Callycophyllum spruceanum Benth (capirona) - Definición conceptual 15 Solución acuosa obtenida mediante maceración con etanol de 70°C de las cortezas de Callycophyllum spruceanum Benth (capirona). Variable dependiente: Efecto antifúngico frente a Candida albicans ATCC 10231 - Definición conceptual Inhibición en el crecimiento de cepas de Candida albicans ATCC 10231 2.4. Técnicas de instrumentos y de recolección de datos: Maceración: Técnica que permitió por medio del contacto con un solvente obtener los principios contenidos en la corteza de la planta21. Difusión en pozo: Permitió determinar por medio de la medida de los halos producidos por los extractos hidroalcohólicos de Calycophyllum sprucenaum que fueron colocados en pocitos en la placa con cultivo del microorganismo22. 2.5. Plan metodológico de la recolección de datos: 2.5.1. Recolección y preparación de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona): - Se recolectó de la muestra 2 kg de corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona), del departamento de San Martin, provincia y distrito de Tarapoto. La corteza obtenida se encontró en óptimas condiciones verificando su buen estado para mejores resultados. - Luego se procedió a lavar la corteza con agua estéril. - A continuación, se dejó secar la corteza a temperatura ambiente por 3 días en papel kraft cuidando de no contaminar la muestra con polvo o cualquier otro tipo de sustancia. 16 - Luego se trozó la corteza en porciones más pequeñas para luego pulverizarla en un molino de cuchillas y luego se colocó en un frasco de boca ancha y color ámbar. 2.5.2. Obtención del extracto hidroalcohólico: - Se pesaron 500 g de la corteza pulverizada de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona), la misma que se colocó en el frasco ámbar de 4 Litros de capacidad y se agregó 1 litro de etanol de 70°, se dejó macerar por 10 días y se agitó por 4 minutos dos veces al día. 2.5.3. Activación y sembrado de la cepa: - La cepa de Candida albicans ATCC 10231 fue reactivada en caldo dextrosa Sabouraud. Los cultivos de Candida albicans ATCC 10231 se incubaron a 37°C en un lapso de 24 a 48 horas. - Una vez obtenido el cultivo se procedió a diluir según la escala de MacFarland 0.5. - Con las placas ya preparadas con agar dextrosa Sabouraud y con la ayuda de un asa bacteriológica estéril se procedió hacer la siembra de la cepa y llevar a incubación a 37°C por 24 horas23. 2.5.4. Evaluación de la actividad antimicótica y medición de los halos: - En una placa se prepararon 3 pocitos para las concentraciones de 50%, 75 % y 100% de los extractos de la planta. - En otra placa se prepararon dos pocitos para el control positivo (nistatina) y control negativo (etanol 70°) - Se realizaron 15 repeticiones por placa y se llevaron a incubación por 24 horas a 37°C. 17 - Luego se retiraron las placas de la incubadora y se procedió a leer los halos de inhibición formados con un vernier digital, para continuar con el registro los datos en la ficha de recolección. 2.6. Procesamiento del análisis estadístico: Los datos recolectados fueron registrados en una base de datos en Excel y luego importados al programa estadístico SPSS versión 26 para obtener la estadística descriptiva e inferencial de los datos mediante las pruebas de normalidad, homogeneidad de varianzas, ANOVA y Tukey, con un nivel de significancia de 0.5%24. 2.7. Aspectos éticos: Dentro de los principios éticos se consideraró el principio de no maleficiencia, por lo tanto, se mantuvieron las medidas de bioseguridad necesarias en los laboratorios de ensayo, manejo de protocolos para prevención del COVID-19 y manejo de residuos biocontaminados, según los estándares MINSA25,26. 18 III. RESULTADOS Tabla 1. Análisis estadístico descriptivo para los datos recolectados de los halos de inhibición promedio 95% del intervalo de confianza para Diámetro del halo la media de inhibición Límite Desv. Desv. Límite superio N Media Desviación Error inferior r Mínimo Máximo Ext. Alc. 1 16,47 0,44 0,11 16,22 16,71 15,78 17,29 Capirona - 100% 5 Ext. Alc. 1 11,05 0,25 0,07 10,91 11,19 10,63 11,58 Capirona - 75% 5 Ext. Alc. 1 9,11 0,43 0,11 8,87 9,35 8,42 9,98 Capirona - 50% 5 Control Negativo 1 5,98 0,41 0,11 5,75 6,20 5,32 6,57 (etanol) 5 Control Positivo 1 26,66 0,40 0,10 26,44 26,88 25,96 27,22 (nistatina) 5 Total 7 13,85 7,31 0,84 12,17 15,54 5,32 27,22 5 Fuente: SPSS ver. 26 La tabla 1 muestra el análisis estadístico descriptivo realizado a los datos recolectados con respecto a los diámetros de los halos de inhibición obtenidos para cada grupo de datos, con respecto a los grupos experimentales se obtuvieron halos de inhibición de 16,47 + 0,44mm IC: 16,22 -16,71 para el extracto de capirona al 100%; de 11,05 + 0,25mm IC: 10,91 -11,19 para el extracto de capirona al 75%; de 9,11 + 0,43mm IC: 5,75 -6,20 para el extracto de capirona al 50%; los grupos control obtuvieron halos de 5,98 + 0,41mm IC: 5,75 - 6,20 para el control negativo y para el control positivo fue de 26,66 + 0,40mm IC: 26,44 - 26,88. 19 Tabla 2. Análisis comparativo de las medias de cada grupo mediante ANOVA Diámetro del halo de inhibición Suma de Media al cuadrados Df cuadrado F p-valor. Entre grupos 3948,129 4 987,032 6426,12 0,000 6 Dentro de 10,752 7 0,154 grupos 0 Total 3958,880 7 4 Fuente: SPSS ver. 26 Interpretación: La tabla 2, muestra el análisis comparativo de los valores promedio del diámetro de los halos de inhibición mediante el Análisis de Varianza (ANOVA), la prueba aplicada obtuvo un valor p-valor= 0,00; siendo este valor inferior al nivel de significancia de 0,05; se demuestra que los grupos de datos analizados presentan diferentes significativas en las medias de los halos de inhibición en al menos unos de los grupos estudiados. Tabla 3. Análisis de las medias de los halos de inhibición mediante la prueba de Tukey por sub grupos homogéneos HSD Tukeya Grupos de trabajo N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 4 5 Control Negativo (etanol) 15 5,97 Ext. Alc. Capirona - 50% 15 9,11 Ext. Alc. Capirona - 75% 15 11,05 Ext. Alc. Capirona - 100% 15 16,46 Control Positivo (nistatina) 15 26,6 5 Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,00 0 Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 15,000. Fuente: SPSS ver. 26 20 La tabla 3, permite determinar el efecto antifúngico en función de los halos de inhibición del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) mediante el análisis de la prueba de Tukey por sub grupos homogéneos. Se observa que todos los grupos de tratamientos presentan diferencias significativas con respecto a sus medias, siendo el control negativo el grupo de comparación sin efecto antifúngico con halo de inhibición promedio de 5,97mm, los grupos experimentales presentaron efecto antifúngico creciente con halos de inhibición promedio de 9,11mm; 11,05mm; 16,46mm para los extractos al 50%, 75% y 100%; el control positivo (nistatina) obtuvo un halo de inhibición de 26,65mm. Tabla 4. Sensibilidad antibacteriana según la escala de Duraffourd Sensibilidad Muy Altamente Sensible Tratamiento nula sensible sensible 8–14 mm < 8 mm 14-20 mm > 20 mm Control Negativo 5,97 (etanol) Ext. Alc. Capirona - 9,11 50% Ext. Alc. Capirona - 11,05 75% Ext. Alc. Capirona - 16,46 100% Control Positivo 26,65 (nistatina) En la tabla 4, se aprecia la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 frente a los grupos de tratamiento en función del tamaño del halo de inhibición tomando como referencia la escala de Durafourd; en tal sentido, se observa que Candida albicans ATCC 10231 presenta sensibilidad nula para el control negativo (etanol), es sensible al extracto alcohólico de capirona al 50% y 75%, es muy sensible al extracto alcohólico de capirona al 100% y altamente sensible al control positivo de nistatina. 21 IV. DISCUSIÓN 4.1. Discusión Las infecciones micóticas se muestran como un tipo de enfermedad que genera altos índices de morbilidad especialmente por la especie Cándida albicans, la que presentan de igual manera altos índices de resistencia a los antifúngicos, en tal sentido, la presente investigación permite demostrar el efecto antifúngico del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Cándida albicans ATCC 10231, los resultados se presentan a continuación: Los halos de inhibición obtenidos por los extractos hidroalcohólicos de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Candida albicans ATCC 10231 fueron de 16,47 + 0,44mm para el extracto de capirona al 100%; de 11,05 + 0,25mm para el extracto de capirona al 75%; de 9,11 + 0,43mm para el extracto de capirona al 50%; los grupos control obtuvieron halos de 5,98 + 0,41mm para el control negativo y para el control positivo fue de 26,66 + 0,40mm. Los resultados se corroboran con los estudios realizados por Roca M. (2019) mediante su estudio realizado de los extractos acuosos, etanólicos y metanólicos de las hojas y corteza de capirona (Calycophyllum spruceanum Benth) frente a Candida albicans, observando que los extractos etanólicos de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth presentan mayor efecto contra C. albicans que el extracto metanolico, observándose este efecto a partir de la concentración de 50 mg/mL. Por otro lado, el estudio de Prado, M. demostró mediante un estudio fitoquímico que Calycophyllum spruceanum Benth “capirona” presenta metabolitos activos como azucares, saponinas, quinonas, flavonoides, cumarinas, iridoides y taninos condensados, siendo uno o varios de estas sustancias las responsables de las propiedades medicinales y antimicóticas de la especie vegetal. 22 Parar determinar el efecto antifúngico del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) comparado con nistatina frente a Candida albicans ATCC 10231 se procedió a aplicar las pruebas inferenciales de ANOVA y Tukey con un nivel de significancia del 0,05 encontrando que existe diferencia significativa entre todos los grupos de datos analizados, la prueba de Tukey confirmo de los grupos experimentales presenta menor efecto antifúngico que el grupo control de nistatina. Se determinó la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 frente al extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) a diferentes concentraciones mediante la escala de Durafourd como se muestra en la tabla 4, los resultados de los halos de inhibición del estudio determinaron que Candida albicans presenta sensibilidad nula al control negativo (etanol); es sensible al extracto hidroalcohólico de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 50% y 75%; es muy sensible al extracto hidroalcohólico al 100% y altamente sensible al control positivo (nistatina). 4.2. Conclusiones - Se demostró el objetivo general del presente estudio y se determinó el efecto antifúngico in vitro del extracto hidroalcoholico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Cándida albicans ATCC 1023. − Se determinó el efecto antifúngico del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 50% mediante la formación de halo de inhibición promedio de 9,11 + 0,43mm frente a Cándida albicans ATCC 10231, siendo esta sensible al extracto. − Se determinó el efecto antifúngico del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 75% mediante la formación de halo de inhibición promedio de 11,05 + 23 0,25mm frente a Cándida albicans ATCC 10231, siendo esta sensible al extracto. − Se determinó el efecto antifúngico del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 100% mediante la formación de halo de inhibición promedio de 16,47 + 0,44mm frente a Cándida albicans ATCC 10231, siendo esta muy sensible al extracto. − El efecto antifúngico del extracto hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Candida albicans ATCC 10231 es menor que la nistatina. 4.3. Recomendaciones − Se recomienda a los futuros investigadores seguir realizando estudios sobre la actividad antifúngica de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) − Se requiere identificar los metabolitos secundarios contenidos en la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) mediante procedimientos análiticos que permitan potenciar su efecto antifúngico. − Es necesario promover la investigación de las diferentes partes de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) para determinar donde se encuentran en mayor cantidad los principios activos con mayor capacidad antifúngica. 24 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. La candidiasis persiste por una mutación del hongo [Internet]. El Mundoes. Salud. 2016. Disponible en: https://www.elmundo.es/elmundosalud/2006/07/28/biociencia/1154075632 .html 2. Saenz M. Manifestaciones cutáneas de las enfermedades sistémicas. Rev Médica Clínica Las Condes [Internet]. 1 de noviembre de 2016;22(6):749- 56. Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-revista-medica- clinica-las-condes-202-articulo-manifestaciones-cutaneas-enfermedades- sistemicas-S0716864011704874 3. Cortés J, Ruiz J, Melgarejo L, Lemos E. Candidemia en Colombia. Biomédica [Internet]. 2020;40:195-207. Disponible en: https://doi.org/10.7705/biomedica.4400 4. Mayer F, Wilson D, Hube B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence [Internet]. 2016;4(2):119-28. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3654610/pdf/viru-4-119.pdf 5. Zurita S. Situación de la resistencia antifúngica de especies del género Candida en el Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica [Internet]. 2018;35(1):126-31. Disponible en: https://rpmesp.ins.gob.pe/index.php/rpmesp/article/view/3563/2997 6. Maco L. IS y MM. SUSCEPTIBILIDAD DE CANDIDA ALBICANSA EX- TRACTO ETANOLICO DE CASCARA DE PUNICA GRANA- TUM. Med Natur. 2020;14:59-64. 7. Peixoto H, Roxo M, Koolen H, Da Silva F, Silva E, Braun MS, et al. Calycophyllum spruceanum (Benth.), the Amazonian “Tree of Youth” Prolongs Longevity and Enhances Stress Resistance in Caenorhabditis elegans. Mol A J Synth Chem Nat Prod Chem [Internet]. 2018 [citado 25 de abril de 2022];23(3). Disponible en: /pmc/articles/PMC6017494/ 25 8. Rojas N, Chaves E, García F. Bacteriología diagnóstica [Internet]. Universidad de Costa Rica. Costa Rica: Facultad de Microbiología; 2015. Disponible en: https://es.scribd.com/document/238053742/BACTERIOLOGIA- DIAGNOSTICA 9. Cruz S, Díaz P, Mazón G, Arias D, Calderon M, Herrera A. Genoma de Candida albicans y resistencia a las drogas. Red Rev Científicas América Lat el Caribe, España y Port [Internet]. 2017;33(3):438-50. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/817/81753881018.pdf 10. Dookie R, García A, Silva E, Nunez C, Silva W, Fachin M. Phytochemical study and antimicrobial action of Calycophyllum spruceanum (Mulateiro) | Dookie | Brazilian Journal of Development. Brazilian Journal of Development [Internet]. 2021 [cited 2022 Jun 13];7(5). Available from: https://www.brazilianjournals.com/index.php/BRJD/article/view/30573/240 28 11. Souza A, Karine A, Mirna K, Castilho R, Nobre G, Junqueira R. FITOQUÍMICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS ESPÉCIES LAFOENSIA PACARI E CALYCOPHYLLUM SPRUCEANUM. Enciclopedia Biosfera, Centro Cientifico Conhecer-Goiania [Internet]. 2018;15(28). Available from: https://www.conhecer.org.br/enciclop/2018B/SAU/fitoquimicos.pdf 12. Magrini V, Fernández A, Fraige K, Siqueira D, Bolzani V. Phytochemical study of Calycophyllum spruceanum Benth ( Rubiaceae ) an Amazonian plant species traditionally used as skin protection , aiming at the identification of compounds useful for the cosmetic sector. Atibaia _SP- Brazil. 2016;1996. 13. Colque Manya B. FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA IN VITRO DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LA CORTEZA DE Calycophyllum spruceanum (benth) hook.f.ex k Schuman 26 (capirona de altura) FRENTE A LA CEPA DE Candida albicans ATCC 2091 TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES. [cited 2022 Jun 13]; Available from: https://orcid.org/0000-0002-4424-7684 14. Gamboa M, Miranda E. Evaluacion de la actividad cicatrizante y toxicidad dermica del gel a base de extracto etanólico de la corteza de Calycophyllum spruceanum (Benth) Hook f. ex K. Schum “Capirona” en ratas albinas Holtzman. [Internet]. 2020. Available from: http://repositorio.uwiener.edu.pe/bitstream/handle/123456789/5094/T061_ 70085969_73986702_T.pdf?sequence=1&isAllowed=y 15. Roca M. Actividad bactericida y fungicida de tres tipos de extractos de hoja y cortez de capir [Internet]. 2019. Disponible en: https://repositorio.unas.edu.pe/bitstream/handle/UNAS/1431/MFRC_2019. pdf?sequence=1&isAllowed=y 16. Hernández R, Fernández C, Baptista P. Metodología de la Investigación [Internet]. 6ta ed. México, D.F.: Mc Graw Hill; 2014. Disponible en: https://periodicooficial.jalisco.gob.mx/sites/periodicooficial.jalisco.gob.mx/fil es/metodologia_de_la_investigacion_-_roberto_hernandez_sampieri.pdf 17. Anonimo. El diseño de investigación experimental [Internet]. 2016. Disponible en: http://histologia.ugr.es/pdf/Metodologia_III.pdf 18. Júnior R, Carrasco O, David R, Toledo V, Hansen OS. Percepción y actitudes hacia la investigación científica. Acad ISSN-e 2414-8938, Vol 5, No 2, 2018 (Ejemplar Dedic a Julio-Diciembre), págs 101-109 [Internet]. 2018 [citado 17 de febrero de 2022];5(2):101-9. Disponible en: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=6566335&info=resumen& idioma=SPA 19. Ríos R. Metodología para la investigación y redacción. Primera. España: Universidad de Málaga; 2017. 20. Hernández C. y Carpio N. Introducción a los tipos de muestreo. Rev 27 Científica del Inst Nac Salud «Alerta». 2019;2(1):75-9. 21. Farmacopea Britanica. Extractos. En: British Pharmacopoeia Vol III [Internet]. 2017. Disponible en: https://www.plantas-medicinal- farmacognosia.com/temas/extractos/ 22. Hudzicki J. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol Author Information. Am Soc Microbiol [Internet]. 2016;(December 2009):1-13. Disponible en: https://www.asm.org/Protocols/Kirby-Bauer-Disk-Diffusion- Susceptibility-Test-Pro 23. Clinical and Laboratory Standards Institute. M100: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 30th Edition [Internet]. CLSI. 2020. Disponible en: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ 24. Díaz V. Metodología de la Investigación Científica y Bioestadística [Internet]. 2da ed. RIL®, editor. Chile: Universidad Finis Terrae; 2010. 564 p. Disponible en: https://www.digitaliapublishing.com/a/29778/metodologia-de-la- investigacion-cientifica-y-bioestadistica--2a-ed.- 25. Zurita S. Urcia F. Manual De Procedimientos Técnicos Para El Diagnóstico Micológico [Internet]. 2017. 139 p. Disponible en: https://repositorio.ins.gob.pe/bitstream/handle/INS/915/Manual de procedimientos tecnicos para el diagnostico micologico.final.pdf?sequence=1 26. MINSA/DIGESA. Norma Técnica de Salud : " Gestión y Manejo de Residuos Sólidos en Establecimientos de Salud y Servicios Médicos de Apoyo a nivel Nacional ". Norma Tec Salud N° N° 096- MINSA/DIGESA- V01. 2010;1:63. 28 ANEXO 29 Anexo A. Instrumentos de recolección de datos Extracto alcohólico de Grupos control Calycophyllum spruceanum N° de Benth Repeticiones 50% 75% 100% Negativ Positiv o o 1 9,15 11,11 16,37 6,05 26,63 2 9,74 11,33 16,28 6,17 26,96 3 8,42 11,58 16,65 5,96 26,57 4 8,70 11,18 16,22 6,28 26,85 5 8,62 10,87 16,82 6,03 25,96 6 9,06 11,41 16,59 5,34 27,22 7 9,98 10,91 17,29 6,36 26,90 8 9,05 10,90 16,28 5,92 26,45 9 9,25 10,73 15,89 5,71 27,13 10 8,88 11,02 16,88 5,39 27,10 11 8,83 11,17 16,33 6,40 26,22 12 9,41 10,90 16,13 6,41 26,39 13 9,30 11,05 15,78 6,57 26,85 14 9,52 10,63 17,23 5,72 26,00 15 8,75 11,02 16,29 5,32 26,65 30 Anexo B. Matriz de consistencia EFECTO ANTIFÚNGICO in vitro DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LA CORTEZA DE Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) FRENTE A Cándida albicans ATCC 10231 Formulación del problema Objetivos Hipótesis Problema General Objetivo General Hipótesis General ¿Cuál será el efecto antifúngico del extracto Demostrar el efecto antifúngico in vitro del extracto El extracto hidroalcoholico de la corteza de hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum hidroalcoholico de la corteza de Calycophyllum Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) presenta spruceanum Benth (capirona) ante a Candida spruceanum Benth (capirona) frente a Cándida efecto antifúngico in vitro del frente a Cándida albicans albicans ATCC 10231? albicans ATCC 10231 ATCC 10231 Problemas Específicos Objetivos Específicos Hipótesis Específicas ¿Presentará efecto antifúngico el extracto Determinar el efecto antifúngico del extracto El extracto hidroalcohólico de la corteza de hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 50% spruceanum Benth (capirona) al 50% frente a spruceanum Benth (capirona) al 50% frente a presenta efecto antifúngico frente a Cándida albicans Cándida albicans ATCC 10231? Cándida albicans ATCC 10231 ATCC 10231 ¿Presentará efecto antifúngico el extracto Determinar el efecto antifúngico el extracto El extracto hidroalcohólico de la corteza de hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 75% spruceanum Benth (capirona) al 75% frente a spruceanum Benth (capirona) al 75% frente a presenta efecto antifúngico frente a Cándida albicans Cándida albicans ATCC 10231? Cándida albicans ATCC 10231 ATCC 10231 ¿Presentará efecto antifúngico el extracto Determinar el efecto antifúngico el extracto El extracto hidroalcohólico de la corteza de hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) al 100% spruceanum Benth (capirona) al 100% frente a spruceanum Benth (capirona) al 100% frente a presenta efecto antifúngico frente a Cándida albicans Cándida albicans ATCC 10231? Cándida albicans ATCC 10231 ATCC 10231 ¿Cuál será el efecto antifúngico del extracto Comparar el efecto antifúngico del extracto El extracto hidroalcohólico de la corteza de hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum hidroalcohólico de la corteza de Calycophyllum Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) presenta spruceanum Benth (capirona) comparado con spruceanum Benth (capirona) con nistatina frente a mayor efecto antifúngico frente a Candida albicans nistatina frente a Candida albicans ATCC 10231? Candida albicans ATCC 10231 ATCC 10231 comparado con nistatina. 31 Anexo C. Operacionalización de las variables ESCALA N° DE DEFINICIÓN DEFINICIÓN INDICADORE DE VARIABLES DIMENSIONES ÍTEM VALOR CONCEPTUAL OPERACIONAL S MEDICIÓ S N Solución acuosa 100 obtenida mediante Extracto maceración con etanol Extracto hidroalcohólico de de 70°C de las hidroalcoholico Callycophyllum cortezas de obtenido por Concentraciones 75 Ordinal 3 % spruceanum Benth Callycophyllum medio de (capirona) spruceanum Benth maceración (capirona). 50 ≤ 8mm Nula Respuesta inhibitoria Medición de los Sensibl Efecto antifúngico Diámetro del en el crecimiento de halos de e frente a Candida halo de 8mm a 14mm Ordinal 4 Candida albicans inhibición albicans inhibición 15mm a Medio ATCC 10231 formados 20mm Muy ˃ a 20mm sensible 32 Anexo D. Análisis estadístico paramétrico de los datos recolectados Figura: 1. Efecto antifúngico de los extractos alcohólicos de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) frente a Candida albicans ATCC 10231. 30.00 26… 25.00 20.00 16.47 15.00 9.11 10.00 11.05 5.00 5.98 0.00 Ext. Alc. Capirona Ext. Alc. Capirona Ext. Alc. Capirona - Control Negativo Control Positivo - 100% - 75% 50% (etanol) (nistatina) GRUPOS DE TRABAJO Fuente: SPSS ver. 26 Interpretación: La figura 1 muestra el comportamiento del efecto antifúngico en función del tamaño del diámetro del halo de inhibición, se observa un efecto creciente de los extractos alcohólicos de la corteza de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) con respecto a la concentración, el control negativo muestra el menor tamaño del diámetro del halo de inhibición, y el control positivo (nistatina) representa el mayor efecto antifúngico. 33 MEDIA DE DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN Tabla 5. Determinación de la distribución normal de los datos recolectados Shapiro-Wilk Statisti Grupos de trabajo c df Sig. Ext. Alc. Capirona - 0,946 1 0,45 100% 5 8 Ext. Alc. Capirona - 0,974 1 0,91 Diámetro del halo de 75% 5 3 inhibición (mm) Ext. Alc. Capirona - 0,980 1 0,97 50% 5 2 Control Negativo 0,934 1 0,30 (etanol) 5 8 Control Positivo 0,951 1 0,54 (nistatina) 5 0 Fuente: SPSS ver. 26 En la tabla 5, se determinó el comportamiento de los datos recolectados en función al tipo de distribución, para tal efecto se aplicó la prueba de Shapiro-Wilk, a cada grupo de datos estudiados obteniendo en todos los casos valores de significancia superiores al 0,05, en tal sentido se confirma que existe un comportamiento normal en la distribución de los datos recolectados en todos los grupos de tratamientos. 34 Tabla 6. Prueba de homogeneidad de varianzas (Levene) Estadístico df p- de Levene 1 df2 valor Se basa en la 1,303 4 70 0,277 media Se basa en la 0,983 4 70 0,423 Diámetro del mediana halo de Se basa en la 0,983 4 60,44 0,424 inhibición mediana y con gl 6 ajustado Se basa en la 1,295 4 70 0,280 media recortada Fuente: SPSS ver. 26 En la tabla 6, se realizó el análisis de la homogeneidad de la varianza mediante la aplicación de la prueba de Levene, esta prueba obtuvo un p- valor de 0,277 basado en la media, lo que confirma que las medias de los grupos analizados presentan varianzas homogéneas. 35 Anexo E. Certificado de Candida albicans ATCC 10231 36 37 Anexo F. Identificación taxonómica de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) 38 Anexo G. Evidencias de la parte experimental de la investigación Figura 1. Recolección de la muestra 39 Figura 2. Aplicando criterios de selección en la muestra Figura 3. Lavado y secado de la muestra 40 Figura 4. Pulverizado de la muestra 41 Figura 5. Procedimiento de maceración 42 Figura 6. Filtrado del macerado obtenido 43 Figura 7. Preparación de los extractos de Calycophyllum spruceanum Benth (capirona) 44 Figura 8. Activación de la cepa de Candida alibcans ATCC ATCC 10231 45 Figura 9. Preparación del inóculo - Escala de McFarland 46 47 Figura 10. Sembrado del inóculo Figura 11. Acondicionamiento de los pocitos en cultivos en agar 48 Figura 12. Aplicación de los extractos 49 50 Figura 13. Formación de los halos de inhibición 51 Figura: 14. Medición de los halos de inhibición 52 53