FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA PARA LA IDENTIFICACIÓN Y
CUANTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
DE AMBROXOL CLORHIDRATO 7,5mg + CLENBUTEROL CLORHIDRATO
0,005mg/5mL EN JARABE.
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO
AUTORES
BACH: CAMONES VARGAS, FLOR ANA
https://orcid.org/0000-0001-9649-3687
BACH: VIDAL SANCHEZ, KAREN PRISCILA
https://orcid.org/0000-0002-9205-5660
ASESOR
MG. HERNANDEZ GUERRA, REYNA EMPERATRIZ
https://orcid.org/0000-0002-4844-8539
LIMA – PERÚ
2021
1
DEDICATORIA:
Lleno de regocijo, de amor y esperanza, dedico este proyecto a Dios Padre, por
los cuidados, por permitirme sonreír ante todos mis logros y darme luz en días
oscuros.
Con todo mi corazón a mi madre, el principal motor de mi vida y mi guía, su
bendición a diario me protege y me lleva por el camino del bien.
A mi padre por ser el impulso de mis sueños, gracias por siempre confiar en mí,
creer en mí, por siempre acompañarme en cada una de las agotadoras y largas
noches de estudio, gracias por cada palabra que fueron mi guía en el transcurso
de la carrera.
Gracias por estar presentes día a día, a mis hermanos: Fredegungo Avellaneda,
Wilmer Avellaneda, Wilson Avellaneda, María Avellaneda, Miguel Diaz, Anderson
Camones, Jhonatan Camones, Claudia Camones, gracias por tanto apoyo
incondicional y ser el orgullo de todos ellos.
Camones Vargas, Flor Ana
Es de mi agrado poder dedicar este trabajo a Dios, por la dicha de concederme
vida y salud hasta el momento, y la oportunidad de estudiar esta emocionante
carrera.
A mi madre e hija, por ser el soporte de que siga esforzándome personal y
profesionalmente.
A mi estimado amigo y padre de mi hija, por alentarme, motivarme y entre risas,
consejos, y altibajos, apoyarme a seguir avanzando.
A mis hermanos con cariño, no es fácil, pero se puede lograrlo.
A mi abuelita Anita, que, aunque no esté conmigo, supo inculcarme desde
pequeña valores y aprendizajes de vida que hoy me permite ser la mujer que soy.
       Vidal Sánchez, Karen Priscila
2
AGRADECIMIENTO
Agradecer a Dios por su infinito amor, bondad y misericordia que nos permite
disfrutar con cada amanecer un nuevo día.
A nuestros padres por educarnos bajos sus principios de amor, humildad y
esfuerzo, pues de ellos aprendimos a valorar lo que hoy somos y ahora tenemos.
A grandes amigos y personas especiales que nos han apoyado en el desarrollo de
este trabajo de investigación.
A nuestra asesora, la Mg. Reyna Emperatriz Hernández Guerra, por su tiempo,
indicaciones de mejoras continuas en el presente estudio.
A laboratorios S.J. Roxfarma, por permitirnos utilizar las instalaciones, equipos y
todo lo necesario para la reproducibilidad y desarrollo del presente trabajo.
3
ÍNDICE GENERAL
Pág.
RESUMEN…………………………………………………………………………………9
ABSTRACT…………………………………………………………………….…….….10
I. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………..……..11
II. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………......18
2.1 Enfoque y diseño de la investigación……………………………………..18
2.2 Población, muestra y muestreo………………………………………...…18
2.3 Variables de la investigación………………………………………………18
2.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos………………………19
2.5 Plan metodológico de recolección de datos……………………….….…19
2.6 Procesamiento del análisis estadístico……………………….………….52
2.7 Aspectos éticos………………………………………………………..……58
III. RESULTADOS………………………………………………………………….....…59
IV. DISCUSIÓN……………………………………………………………..……………91
4.1 Discusión de resultados……………………………………………………91
4.2 Conclusiones…………………………………………………………...…..95
4.3 Recomendaciones……………………………………………………...….97
REFERENCIAS  BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………….……98
ANEXOS.…………………………………………………………………………………98
a. Instrumentos de recolección de datos…………………………………………98
b. Matriz de consistencia………………………………………………………....115
c. Operacionalización de variables……………………………………………...116
d. Carta de aprobación para la ejecución del proyecto de
tesis……………..………………………………………………………….……118
e. Evidencias fotográficas del trabajo de campo………………………………119
4
ÍNDICE DE TABLAS.
Tabla 1. Variación de flujo………………………………………………………………22
Tabla 2. Variación de longitud de onda………………………………………………..22
Tabla 3. Número de muestras y número de inyecciones-Aptitud del sistema……...24
Tabla 4. Número de muestras y número de inyecciones-Especificidad por
identificación………………………………………………………………………….….27
Tabla 5. Número de muestras y número de inyecciones-Especificidad por
degradación……………………………………………………………………………...36
Tabla 6. Número de muestras y número de inyecciones-Linealidad del sistema…40
Tabla 7. Número de muestras y número de inyecciones-Linealidad del método…43
Tabla 8. Número de muestras y número de inyecciones-Exactitud del método…...45
Tabla 9. Número de muestras y número de inyecciones – P. Repetibilidad………46
Tabla 10. Número de muestras y número de inyecciones-P.I. diferente analista...47
Tabla 11. Número de muestras y número de inyecciones-P.I. diferentes equipos.47
Tabla 12. Número de muestras y número de inyecciones - Límite de Detección y
Cuantificación……………………………………………………………………………49
Tabla 13. Número de muestras y número de inyecciones-Robustez………………50
Tabla 14. Evaluación de los resultados de la aptitud del sistema cromatográfico de
ambroxol…………………………………………………………………………….……59
Tabla 15. Resultados de la aptitud del sistema cromatográfico de ambroxol………59
Tabla 16. Evaluación de los resultados de la aptitud del sistema cromatográfico de
clenbuterol………………………………………………………………………………..60
Tabla 17. Resultados de la aptitud del sistema cromatográfico de clenbuterol……60
Tabla 18. Evaluación de los resultados de Especificidad por Identificación……….61
5
Tabla 19. Evaluación de los resultados de Especificidad por Degradación………..63
Tabla 20. Resultados de Especificidad por Degradación de Ambroxol…………….64
Tabla 21: Resultados de Especificidad por Degradación de Clenbuterol…………..66
Tabla 22: Evaluación de los resultados de Linealidad del Sistema…………………68
Tabla 23: Resultados de la Linealidad del sistema para Ambroxol-serie 1…………69
Tabla 24: Resultados de la Linealidad del sistema para Ambroxol-serie 2…………70
Tabla 25: Resultados de la Linealidad del sistema para Ambroxol-serie 3…………71
Tabla 26: Resultados de la Linealidad del sistema para Clenbuterol-serie 1………72
Tabla 27: Resultados de la Linealidad del sistema para Clenbuterol-serie 2……....73
Tabla 28: Resultados de la Linealidad del sistema para Clenbuterol serie 3………74
Tabla 29. Evaluación de los resultados de Linealidad del método………………….75
Tabla 30: Resultados de la Linealidad del método para Ambroxol………………….76
Tabla 31: Resultados de la Linealidad del método para Clenbuterol……………….77
Tabla 32. Evaluación de los resultados de Exactitud del método…………………...78
Tabla 33: Resultados de la exactitud del método para Ambroxol…………………..79
Tabla 34: Resultados de la exactitud del método para Clenbuterol…………………80
Tabla 35. Evaluación de los resultados de Precisión del método…………………...81
Tabla 36: Resultados de Precisión: Repetibilidad en Ambroxol…………………….82
Tabla 37: Resultados de Precisión: Repetibilidad en Clenbuterol…………………..83
Tabla 38: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes analistas para
Ambroxol………………………………………………………………………………....83
Tabla 39: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes equipos para
Ambroxol…………………………………………………………………………………84
Tabla 40: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes analistas para
Clenbuterol……………………………………………………………………………….84
6
Tabla 41: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes equipos para
Clenbuterol…………………………………………………………………….…………85
Tabla 42: Evaluación de los resultados de Límite de Detección y Cuantificación…85
Tabla 43: Resultados de límite de cuantificación y detección para Ambroxol……...86
Tabla 44: Resultados de límite de cuantificación y detección para Clenbuterol…...87
Tabla 45. Evaluación de los resultados de Robustez………………………………...88
Tabla 46: Resultados de Robustez en Ambroxol…………………………………….89
Tabla 47: Resultados de Robustez en Clenbuterol…………………………………..90
Tabla 48. Evaluación de los resultados del Rango……………………………….......90
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 1 – Ambroxol…………………..70
Figura 2: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 2 – Ambroxol…………………71
Figura 3: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 3 – Ambroxol…………………..72
Figura 4: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 1 – Clenbuterol………………73
Figura 5: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 2 – Clenbuterol………..………74
Figura 6: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 3 – Clenbuterol…………….….75
Figura 7: Gráfica de la Linealidad del método – Ambroxol………………….……….77
Figura 8: Gráfica de la Linealidad del método – Clenbuterol………………..……….78
Figura 9: Gráfica del Límite de detección y cuantificación para Ambroxol………….86
Figura 10: Gráfica del Límite de detección y cuantificación para Clenbuterol……...87
Figura 11: Cromatograma de Ambroxol + Clenbuterol en aptitud del sistema del
estándar 1………………………………………………………………………….……108
Figura 12: Cromatograma de Ambroxol + clenbuterol en aptitud del sistema del
estándar 2……………………………………………………………………………….108
Figura 13: Especificidad por identificación de la fase móvil………………………..109
Figura 14: Especificidad por identificación del analito Ambroxol…………………..110
Figura 15: Especificidad por identificación del analito Clenbuterol………………..111
Figura 16: Especificidad por identificación del estándar mixto…………………….112
Figura 17: Especificidad por identificación del producto terminado……………….113
Figura 18: Especificidad por identificación del Placebo…………………………….114
Figura 19: Tesistas preparando las soluciones de trabajo para el desarrollo de la
validación de la técnica analítica ……………………………………………………..119
Figura 20: Tesistas analizando las muestras antes de introducir al cromatógrafo.120
8
Figura 21: Tesistas evaluando los resultados generados por el cromatógrafo…120
RESUMEN
OBJETIVO: Validar la técnica analítica para la identificación y cuantificación por
cromatografía líquida de alta resolución de Ambroxol Clorhidrato 7,5mg +
Clenbuterol clorhidrato 0.005mg/5mL en jarabe.
MATERIALES Y MÉTODOS: Consistió en la identificación, cuantificación y
separación de los principios activos en el sistema cromatográfico y se evaluó los
parámetros de desempeño: especificidad, linealidad, exactitud, precisión, límite de
detección y cuantificación, robustez y rango.
RESULTADOS: La técnica analítica es específica, puesto que no presenta
interferencia con ningún compuesto de degradación del principio activo o algún
excipiente. Es lineal, muestra proporcionalidad con la concentración del analito,
donde el coeficiente de correlación (r) para el sistema y el método fueron r≥0.995
que es su valor aceptable. Es exacta, obteniéndose un porcentaje de recuperación
de 100.1% en ambroxol y 100.5% en clenbuterol. Es precisa, con un coeficiente de
variación (CV) para repetibilidad en ambroxol del 0.16% y en clenbuterol 0.41%,
para precisión intermedia entre diferentes analistas, se obtuvo 0.23 y 1% en
ambroxol y clenbuterol respectivamente y entre diferentes equipos 0.48% y 1.08%
en ambroxol y clenbuterol respectivamente, el CV ≤ 2.0%. El límite de detección
1.9052ppm y 0.001949ppm en ambroxol y clenbuterol respectivamente. El límite de
cuantificación fue 2.3003ppm en ambroxol y 0.004971ppm en clenbuterol. Es
robusto, el producto terminado no evidencia alteración. El rango obtenido oscila
entre 80%-120%.
CONCLUSIÓN: La técnica analítica validada cumplió con las exigencias
establecidas de la USP vigente y se encuentra aptos para su respectiva utilización.
Palabras Claves: Validación, HPLC, criterio de aceptación, técnica analítica,
parámetros de desempeño.
9
ABSTRACT
OBJETIVE: To validate the analytical technique for the indentification and
quantification by high performance liquid chromatography of Ambroxol
hydrochloride 7,5mg + Clenbuterol hydrochloride 0,005mg/5mL in syrup.
MATERIALS AND METHODS: It consisted of the identification, quantification and
separation of the active ingredients in the chromatographic system and the
performance parameters were evaluated: specificity, linearity, accuracy, precisión,
detection and quantification limit, robustness and range.
RESULTS: The analytical technique is specific, since it does not interfere with any
degradation compound of the active ingredient or any excipient. It is linear, it shows
proportionality with the concentration of the analyte, where the correlation coefficient
(r) for the system and the method were r≥0.995, which is its aceptable value. It is
exact, obtaining a recovery percentage of 100.1% in ambroxol and 100.5% in
clenbuterol. It is precise, with a coefficient of variation (CV) for repeatability in
ambroxol of 0.16% and in clenbuterol 0.41%, for intermediate precisión between
different analysts 0.23 and 1% were obtained in ambroxol and clenbuterol
respectively and between different teams 0.48% and 1.08% in ambroxol and
clenbuterol respectively, the CV ≤ 2.0%. The detection limit 1.9052ppm and
0.001949ppm in ambroxol and clenbuterol respectively. The quantification limit was
2.3003ppm for ambroxol and 0.004971ppm for clenbuterol. It is robust, the finished
producto shows no alteration. The range obtained is between 80%-120%.
CONCLUSION: The validated analytical technique complied with the requirements
established by the current USP and is suitable for it´s respective use.
Keywords: Validation, HPLC, acceptance criterio, analytical technique,
performance parameters.
10
I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad el termino validación viene integrándose como parte imprescindible
en la industria farmacéutica. Básicamente se fundamenta en el proceso de demostrar
que los resultados obtenidos por un determinado método, técnica, procedimiento o
actividad, contribuye con el propósito previsto.1
A nivel mundial cerciorarse del cumplimiento de los procesos de validación viene
llevándose a cabo por los entes reguladores más importantes como son la OMS (
Organización Mundial de la Salud), la FDA (Administración de Medicamentos y
Drogas de los Estados Unidos), la ICH (Consejo Internacional para la Armonización
de requisitos técnicos para productos farmacéuticos de uso humano), la EMA
(Agencia Europea de Medicamentos); siendo la ICH la principal referencia para
recomendaciones y definiciones acerca de las características de validación de los
procedimientos analíticos1, sin embargo la FDA en 1976 determina por primera vez
el concepto de revisión en las normas correctas de fabricación, y siete años
posteriores incluyó criterios orientados a mejorar los validación de procesos.2
La validación de los métodos analíticos son un grupo de procesos y análisis que al
documentarlos nos permite demostrar frente a las entidades farmacéuticas y demás,
la confiabilidad de resultados precisos y exactos, y garantizar productos de calidad
para el cual fueron destinados.3 Por ello en cada país se crearon normativas con el
propósito de regular las etapas del desarrollo de los productos farmacéuticos con el
fin de obtener productos de altos estándares de calidad.
En el Perú, la DIGEMID (Dirección General de Medicamentos Insumos y Drogas)
mediante los manuales de BPM (Buenas Prácticas de Manufactura) y BPL (Buenas
Prácticas de Laboratorio), permiten que se realicen la fabricación de los productos
farmacéuticos con suma confiabilidad, eficacia, calidad y seguridad, para ello los
textos de consultas oficiales como la farmacopea americana, británica, europea y
japonesa, nos proporcionan las técnicas analíticas de muchos de estos activos.4 Sin
embargo, los parámetros de desempeño dados no se alinean a las condiciones de
cada laboratorio en su debido país. Por tal motivo los laboratorios actuales deben
demostrar la aplicabilidad de los métodos analíticos a su producto e instalaciones,
así como la entidad reguladora DIGEMID en el Perú exigirá el cumplimiento de la
11
Validación de los métodos analíticos de cada medicamento que llegue a una etapa
de comercialización .5,6,7
La asociación de ambroxol clorhidrato y clenbuterol clorhidrato que son los principios
activos de nuestro estudio, son una de las combinaciones más usadas y
comercializadas actualmente, por el aporte sinérgico frente a las afecciones
respiratorias más comunes como broncoespasmos, asma bronquial, EPOC, fibrosis
pulmonar, entre otros.8,9
Una de las metodologías de análisis con más uso y de primera elección en la
identificación y cuantificación de analitos es realizado por cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC), método que nos proporciona seguridad y alto grado de
confianza en los resultados de nuestro producto farmacéutico de interés, la
combinación de ambroxol y clenbuterol.10,18
Según lo antes mencionado, el presente trabajo de investigación tiene como énfasis
la Validación de la técnica analítica para la identificación y cuantificación por
cromatografía líquida de alta resolución de ambroxol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe, en las instalaciones de laboratorios
farmacéuticos S.J. Roxfarma, con el fin de documentar que la técnica es aplicable,
reproducible y confiable dentro de los límites esperados mediante la USP vigente.
La definición de validación se presenta de muchas maneras, siendo la propuesta
más aceptada por la FDA como “la evidencia documentada que provee un alto grado
de garantía de que un proceso específico producirá, de forma consistente, un
producto que cumpla con sus especificaciones predeterminadas y atributos de
calidad”11.Teniendo en cuenta esta definición  podemos conceptualizar que la
validación de métodos analíticos es el proceso por el cual queda establecido por
estudios experimentales y/o de laboratorio, que la capacidad del método y
características de desempeño cumple con los requisitos para la aplicación analítica
deseada.1 La clasificación para métodos analíticos se da según la función de su
estado regulatorio, encontrando aquí a los métodos farmacopéicos y los no
farmacopeicos12.Las pruebas analíticas farmacopéicas se pueden evaluar según los
parámetros de cuatro categorías (USP43): categoría I, para cuantificar componentes
principales de los fármacos a granel o activos (incluidos conservantes) en productos
terminados. Categoría II, para determinar impurezas en fármacos a granel o residuos
12
de degradación, en estos procedimientos incluyen pruebas de límite y análisis
cuantitativos. Categoría III, para determinar características de desempeño como
disolución, liberación de fármacos. Categoría IV, para pruebas de identificación.3,7
Dependiendo de cada categoría se requiere tener en cuenta información analítica
diferente en los parámetros de desempeño como se muestra en el anexo A1.
Los síntomas asociados a las enfermedades respiratorias suelen darse por la tos y
las secreciones traqueo bronquiales, es por ello que combinaciones sinérgicas de
principios activos es una de las alternativas para el tratamiento de este tipo de
afecciones. El Clenbuterol como agente broncodilatador ejerce estimulación sobre
los receptores agonistas B2 adrenérgicos de manera selectiva dilatando los
bronquios oprimidos y el Ambroxol, por sus propiedades mucolíticas actúa
modificando las características fisicoquímicas de la secreción bronquial, rompe los
puentes disulfuros(S2) y realiza la lisis de las mucoproteínas, mejorando el flujo y
transporte de moco para su fácil eliminacion.8,11,13
Entre los antecedentes internacionales y nacionales encontrados respectivamente,
se dispone de los siguientes estudios:
Guillen, J. (2019). En su tesis “Desarrollo y validación de un método analítico para
la determinación simultánea de ambroxol y clenbuterol en jarabe por cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC)” tuvo como objetivo desarrollar y validar un
procedimiento analítico por HPLC para determinar simultáneamente clorhidrato de
ambroxol y clenbuterol en jarabes. En la evaluación de la exactitud se encontraron
porcentajes de recuperación en los niveles 70, 100 y 130% entre (69,34;
100,86;129,69) % y (68,76; 99,16; 127,71) % con coeficiente de variación de (0,38;
0,61; 0,24) y (0,20; 1,63; 0,35) para clenbuterol y ambroxol respectivamente. Los
límites de detección y cuantificación fueron (0,23/0,70) y (0,07/0,22) para clenbuterol
y ambroxol respectivamente. Los resultados demostraron que el método propuesto
fue satisfactorio bajo las condiciones de análisis desarrolladas.8
Morales, J. (2017). En su tesis “Desarrollo de un método para la cuantificación de
clenbuterol y ambroxol en jarabes para la tos por medio de cromatografía líquida de
alta resolución”, la investigación propuso determinar la concentración de clenbuterol
y ambroxol en conjunto en jarabe por HPLC. Sin embargo, esto no fue posible debido
a que el compuesto clenbuterol no se pudo detectar por medio de la metodología
13
propuesta. Para ambroxol la desviación de 2,25 estuvo fuera del criterio; precisión
intermedia fue de 4x10–14, fuera de aceptación; precisión del sistema fue 0,3 lo cual
cumple con el criterio; la linealidad cuyo cociente de regresión de 0,998 por lo que
se considera lineal; el rango fue de 80% al 120% de la concentración de ambroxol,
es decir, de 0,6 a 0,9g/mL. El método no fue el adecuado para la evaluación de este
tipo de jarabes.11
Parra, Z. et al (2017). En su artículo “Desarrollo y validación de un método analítico
por HPLC para la determinación simultánea de clorhidrato de ambroxol y loratadina
en jarabes” describe que su propósito de investigación fue la desarrollar y validar una
metodología por HPLC para la determinación simultánea de clorhidrato de ambroxol
y loratadina en jarabes. La metodología fue validada según los requerimientos de la
USP vigente. El método propuesto fue lineal en un rango de concentración entre
0,12mg/mL a 0,90mg/mL para clorhidrato de ambroxol y 0,02mg/mL a 0,16mg/mL
para loratadina. Los resultados demostraron que el método es robusto y confiable
bajo las condiciones de análisis dadas, asimismo, fue preciso, exacto y selectivo, lo
cual reconoció inequívocamente la presencia de ambroxol y loratadina,
discriminando la presencia de productos de degradación y sustancias
contaminantes. Se concluyó que el método puede ser aplicado para procedimiento
rutinario en pruebas de control de calidad.18
Guarniz, D. (2016) en su tesis “Validación del método analítico por cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) para la cuantificación de ambroxol clorhidrato en
polvo para suspensión oral”. En sus resultados: La linealidad del sistema tuvo un
coeficiente de correlación r=1,000 y 0,9993 la linealidad del método. En la precisión
los valores obtenidos de RSD nos demuestran que el valor máximo permitido es de
2% y el método en repetibilidad tuvo un RSD de 1,155% siendo conforme. El
estándar, muestra, placebo nos demuestran que ningún excipiente interfiere con el
pico del principio activo, por lo tanto, el método es selectivo.14
Acosta M, et al (2014) en su tesis “Validación de una técnica analítica por
cromatografía de alta performance (HPLC) y cálculo de la incertidumbre para los
ensayos de ambroxol clorhidrato y clenbuterol clorhidrato en un jarabe, Arequipa-
2013” tuvieron como objetivo primordial el validar la metodología analítica por HPLC
y calcular la incertidumbre de los principios activos ambroxol y clenbuterol en un
14
jarabe. Evaluaron parámetros como linealidad, precisión, exactitud, especificidad y
rango, obteniéndose resultados adecuados. Demostraron mediante diseño
experimental que la metodología analítica era lineal dado que se obtuvo un
coeficiente de correlación para ambroxol:0,9992 y clenbuterol: 0,9998; lineal en el
rango de 0,09mg/mL a 0,21mg/mL para ambroxol y 0,00030mg/mL a 0,00057mg/mL
para clenbuterol; es precisa ya que el coeficiente de variación para las áreas y los
tiempos fue de ≤2%, la repetibilidad tuvo un coeficiente de variación de 0,80% y
1,38% para ambroxol y clenbuterol respectivamente; es exacta con una recuperación
media de ambroxol del 99,86% y clenbuterol de 99,87%; es especifica dado que no
se evidenció interferencia de productos de degradación o de los excipientes en el
análisis de los principios activos .9
Tapia W.,(2011) en su Informe de investigación tipo III ” Validación de un método
analítico por cromatografía líquida de alta resolución(HPLC) para la cuantificación de
ambroxol clorhidrato 7,5mg/mL solución oral gotas”, se evaluaron en la presente
investigación los parámetros de desempeño como son: Linealidad, precisión,
exactitud, límite de cuantificación y detección, especificidad, robustez y rango, los
cuales concluyeron que el método analítico propuesto es lineal, exacta, precisa,
específica y robusta, lo cual, con este método demostraron confiabilidad
garantizando la fórmula del principio activo analizada19.
El trabajo mencionado por Tapia, es un antecedente relevante, puesto que coincide
con uno de los principios activos estudiados en esta investigación, más aun teniendo
en cuenta la información que brindará para nuestra discusión.
De esta forma justificamos la investigación realizada, puesto que observamos la
necesidad que tiene la industria farmacéutica al no contar con la documentación, el
equipamiento, insumos y los conocimientos necesarios para la aplicación de técnicas
analíticas confiables que pueden demandar gastos de inversión económica, humana
y de tiempo en el desarrollo. Es por ello que se requiere implementar la validación
de nuevos métodos analíticos o la adaptación de los métodos farmacopéicos a las
necesidades de cada laboratorio, siempre garantizando la confiabilidad en los
resultados y el cumplimiento de Buenas Prácticas de Manufactura, Buenas Prácticas
de Laboratorio que demuestren la aplicabilidad del método al producto e
instalaciones.15
15
Al trabajar juntos ambroxol y clenbuterol de manera sinérgica mejorando las vías
respiratorias que cursan con broncoconstricción y dificultad para expulsar las
secreciones bronquiales, este medicamento en el facultativo es de primera elección,
es por ello que se busca que la técnica analítica cumpla con los altos estándares de
calidad.13
El HPLC es el equipo adecuado de mayor alcance para lograr los resultados en la
técnica analítica, este nos permite obtener tiempo de análisis más rápidos, separar
sustancias de mezclas complejas, ejecución de los análisis con facilidad y exactitud,
y con errores relativos menores al 1%.2, 16
Por las razones anteriormente descritas se ha tomado la decisión de validar una
técnica analítica adecuada para el principio activo de nuestro interés rigiéndonos al
marco legal.
El objetivo general de la investigación es validar la técnica analítica para la
identificación y cuantificación por cromatografía líquida de alta resolución de
ambroxol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe.
La hipótesis general de la investigación hace énfasis que:
La validación de la técnica analítica para la identificación y cuantificación por
cromatografía líquida de alta resolución de ambroxol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe cumple con los parámetros establecidos.
16
II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1    Enfoque y diseño de la investigación
2.1.1 Enfoque: La investigación reúne un enfoque cuantitativo. Cuantitativo
porque usa la recolección de datos para probar la hipótesis
basándonos en la medición y análisis estadístico.
2.1.2 Diseño: Es de diseño experimental, porque en el estudio trabajado se
controló la influencia de la variable independiente sobre la variable
dependiente una vez manipulada, observando y vigilando el
procedimiento experimental. Asimismo, se analizó los datos recogidos
con el uso de técnicas estadísticas hasta obtener las conclusiones
respectivas.
2.1.3 Tipo: Prospectivo y longitudinal. Prospectivo, ya que el estudio se inició
antes de los hechos y los datos que se recogieron fueron a medida que
se realizaba el procedimiento. Longitudinal, porque se analizó y
observó la secuencia, modificación o evolución de nuestra muestra a
lo largo de un tiempo.
2.2    Población, muestra, y muestreo
2.2.1 Población: Lote industrial de 1200L de ambroxol clorhidrato 7,5mg +
clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe comercializados por
laboratorios S.J. Roxfarma.
2.2.2 Muestra: Se tomaron 10 frascos de 120mL  de ambroxol clorhidrato
7,5mg + clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe siendo el 0.1%
de la población.
2.2.3 Muestreo: Considerando el tamaño del lote, las muestras se
seleccionaron de manera aleatoria.
2.3    Variables de la investigación
2.3.1 Variable 1: Validación de la técnica analítica por cromatografía líquida
de alta resolución. Es la variable que se ve afectada por la estimulación
de la variable 2.
2.3.2 Variable 2: Identificación y cuantificación de ambroxol clorhidrato
7,5mg + clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe. Es la variable
de estudio, la cual se manipuló para observar los efectos que produjo
sobre la variable 1.
17
2.4    Técnica e instrumentos de recolección de datos
2.4.1 Técnica: Se realizó mediante la observación experimental y el análisis
documentado y proporcionado por el cromatógrafo líquido de alta
resolución1.
2.4.2 Instrumentos: La Hoja de trabajo y registro de datos, como muestra
anexo A2, fueron ingresados a cuadros en sistema Excel y formato
Minitab 1816.
2.5    Plan metodológico para la recolección de datos
El procedimiento para la recolección de datos del estudio se basa en la
observación y realización de lo siguiente:
Se desarrolló y se validó la técnica analítica de nuestra investigación con
metodologías y especificaciones farmacopéicas vigentes, utilizándose el
procedimiento analítico del producto Ambroxol clorhidrato 7,5mg + Clenbuterol
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe brindada por el laboratorio S.J. Roxfarma y
en el caso de pruebas específicas se procedió según el protocolo establecido.
El sistema cromatográfico cumple con las siguientes condiciones: Cromatógrafo
líquido de alta resolución (HPLC) marca Thermo Scientific cuyo modelo es
Dionex 3000 con detector DAD (Diode Array Detectors), UV/VIS (Ultravioleta o
Visible) ajustado a 248nm para ambroxol clorhidrato y 215nm para clenbuterol
clorhidrato. Se usó la columna cromatográfica Octadecilsilano ligado
químicamente a micropartículas de sílice totalmente porosa (L1), cuyas
dimensiones son de 250mm x 4,6mm x 5µm (Eclipse XDB-C18) para ambos
principios activos, a flujo de 1,0mL/minuto dentro de una temperatura a 25ºC con
volumen de inyección 10µL en un tiempo de corrida de aproximadamente 6
minutos para ambroxol clorhidrato y para clenbuterol clorhidrato a flujo de
0.6mL/minuto a 40ºC con volumen de inyección 50µL en un tiempo de corrida de
60 minutos la muestra y 25 minutos el estándar.
Para el desarrollo de la técnica analítica y su respectiva validación se procedió
de la siguiente manera:
18
2.5.1 Estándares:
· Ambroxol clorhidrato.
· Clenbuterol clorhidrato.
2.5.2 Muestra:
· Ambroxol clorhidrato 7,5mg + Clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL.
2.5.3 Reactivos:
· Agua purificada
· Acetonitrilo
· Metanol
· Heptanosulfonato de sodio
· Ácido fosfórico
· Hidróxido de potasio
· Fosfato de monobásico de potasio
· Ácido clorhídrico
· Peróxido de hidrogeno 30%
· Hidróxido de sodio
2.5.4 Instrumentos y equipos:
· Balanza analítica
· Purificador de agua
· Baño ultrasonido
· Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) Thermo
Scientific/Dionex     3000.
· Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC)Thermo
Scientific/Dionex U-3000
· Cromatógrafo liquido de alta resolución (HPLC) Dionex Ultimate 3000
· Refrigeradora
19
· Baño María
· Estufa
· Cámara climática
· Multiparámetro
2.5.5 Materiales
· Vasos de precipitación de 250mL, 500mL.
· Matraz volumétrico de 10mL, 20mL, 50mL, 100mL, 200mL.
· Pipetas volumétricas de 1mL, 2mL, 4mL, 5mL, 10mL.
· Pipetas graduadas de 1mL, 2mL, 5mL, 10mL.
· Probetas de 500mL, 1000mL, 2000mL.
· Membrana filtrante PVDF GVWP02500 de 0,45µm de poro x 25mm.
· Membrana filtrante PVDF HVLP04700 de 0,45µm de poro x 47mm.
· Porta filtros y jeringas descartables.
· Viales de HPLC de 2mL y tapas.
· Columna cromatográfica: Octadecilsilano ligado químicamente
partículas de sílice totalmente porosa (L1) (Zorbax XDB-C18) de
250mm x 4,6mm x 5µm.
2.5.6 Método analítico:
2.5.6.1 Condiciones cromatográficas:
· En la preparación de la fase móvil se mezcló y desgasificó, durante 10
minutos.
· Una hora antes de iniciar el análisis se acondicionó el sistema
cromatográfico.
2.5.6.2 Sistema Cromatográfico:
· Columna: Octadecilsilano ligado químicamente a partículas de sílice
porosa (L1) (Zorbax Eclipse XDB-C18)
· Dimensiones de la Columna: 250mm x 4.6mm x 5µm.
20
· Flujo: Gradiente
Tabla 1: Variación de flujo
Tiempo (min) Flujo
0.00 min 0,90mL/min
34.5 min 0,90mL/min
35.0 min 1,60mL/min
54.5 min 1,60mL/min
54.9 min 0,90mL/min
55.0 min 0,90mL/min
· Temperatura: 35ºC
· Detección: 210nm – 310nm
Tabla 2: Variación de longitud de onda
Tiempo nm
0.00 min 210
35.00 min 310
55.00min 210
· Volumen de inyección: 80µL
· Tiempo de corrida: Aproximadamente 55 minutos
2.5.6.3 Fase móvil:
2.5.6.3.1 Preparación del Buffer pH 3.0: Se pesó 5,0g de fosfato monobásico
de potasio y 3,0g de heptanosulfonato de sodio en un matraz de
1000mL, agregaremos 850mL de agua. Sonicamos hasta disolución
completa y mezclamos. Ajustamos a pH 3.0 con ácido fosfórico
30%(V/V).
2.5.6.3.2 La fase móvil: Buffer pH 3.0: Acetonitrilo: Metanol, (600:105:295) con
las siguientes proporciones respectivamente para 1000mL.Filtramos
a través de la membrana PVDF a 0,45µm, desgasificamos y
trasvasamos a un frasco apropiado.
21
2.5.7 Preparación de las soluciones de trabajo:
2.5.7.1 Diluyente: Ácido Clorhídrico (HCl) 0,1N.
2.5.7.2 Solución estándar mixto: Concentración final (Ambroxol Clorhidrato
0,3mg/mL y Clenbuterol 0,0002mg/mL). Se pesó aproximadamente
20mg de Clenbuterol HCl RS, en un matraz volumétrico de 100mL,
agregamos 30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos; se
completó a volumen con diluyente y mezclamos. De la solución
anterior se transfirió 2,0mL en un matraz volumétrico de 100mL;
completamos a volumen con diluyente y mezclamos para obtener la
solución A.
Pesamos 30mg de ambroxol Clorhidrato, en un matraz volumétrico de
100mL, agregamos 30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos
hasta disolución completa. Transferimos 5,0mL de la solución A; hasta
completar a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.7.3 Solución muestra: Transferimos 5mL de muestra (± 7,5mg de
Ambroxol clorhidrato y 0,005 de Clenbuterol clorhidrato) exactamente
medidos a un matraz volumétrico de 25mL, llevamos a volumen con
diluyente y mezclamos. Se filtró una porción de esta solución a través
de la membrana PVDF de 0,45µm descartando los primeros mililitros
del filtrado. Obteniendo una concentración final de Ambroxol
0,3mg/mL y Clenbuterol Clorhidrato 0,0002mg/mL.
2.5.7.4 Muestra placebo: Transferimos 5,0mL de placebo (± 0,0mg de
Ambroxol Clorhidrato y 0,0mg de Clenbuterol Clorhidrato), medidos
exactamente en un matraz volumétrico de 25mL diluimos y llevamos
a volumen con diluyente mezclamos y homogenizamos.
2.5.7.5 Estándar Ambroxol Clorhidrato: Transferimos 15mg de Ambroxol
clorhidrato a un matraz volumétrico de 50mL, se agregó 30mL de
diluyente y sonicamos por 5 minutos. Llevamos a volumen con
diluyente y homogenizamos.
2.5.7.6 Estándar Clenbuterol Clorhidrato: Transferimos  20mg  de
Clenbuterol clorhidrato y lo colocamos a un matraz volumétrico de
100mL, seguidamente agregamos 30mL de diluyente y sonicamos por
5 minutos, llevamos a volumen con la misma solución y mezclamos.
22
Transferimos 2,0mL solución y llevamos a un matraz volumétrico de
200mL, completamos con diluyente y mezclamos. De la solución
anterior transferimos 2,0mL y llevamos a un matraz de 20mL
diluyendo a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8 Proceso de Validación:
2.5.8.1 Aptitud de Sistema: Se preparó dos muestras del estándar mixto
según el punto 2.5.7.2 detallado antes en la presente investigación;
filtramos una porción de la solución a través de la membrana PVDF
0,45µm hacia los viales HPLC descartando los primeros mililitros del
filtrado.
Luego procedimos a realizar la recolección de datos de 6 inyecciones
del estándar mixto por duplicado y en el ensayo se evaluó la
adecuación del sistema.
Tabla 3: Número de muestras y número de inyecciones- Aptitud
de sistema
Muestras Nº de Muestras Nº de Inyecciones
Estándar Mixto 1 1 6
Estándar Mixto 2 1 6
2.5.8.2 Especificidad:
Capacidad de evaluar de manera evidente y clara el analito en
participación con aquellos componentes cuya presencia pueden
encontrarse como probables, tales como impurezas, productos de
degradación y componentes de la matriz6. Se realizó pruebas de
Especificidad por identificación y Especificidad por degradación.
2.5.8.2.1 Especificidad por Identificación: Se realizó análisis individuales de
cada uno de los componentes de la formula, tomando como referencia
la concentración de cada uno de ellos, según técnica analítica.
23
2.5.8.2.1.1 Estándar mixto (Ambroxol clorhidrato y Clenbuterol
clorhidrato): Se preparó la solución estándar según lo establecido
en el punto 2.5.7.2 detallado anteriormente en la presente
investigación.
2.5.8.2.1.2 Estándar de Ambroxol clorhidrato: Se preparó la solución
estándar según el punto 2.5.7.5 detallado anteriormente en la
presente investigación.
2.5.8.2.1.3 Estándar de Clenbuterol clorhidrato: Se preparó la solución
estándar según el punto 2.5.7.6 detallado previamente en la
presente investigación.
2.5.8.2.1.4 Metilparabeno: Se pesó 36mg de metilparabeno en un matraz
volumétrico de 100mL, se llevó a volumen con diluyente y se
mezcló.
2.5.8.2.1.5 Propilparabeno: Pesamos 20mg de propilparabeno en un matraz
volumétrico de 50mL, diluimos a volumen con diluyente y
mezclamos. Transferimos 5,0mL de esta solución y llevamos a un
matraz volumétrico de 50mL, completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.6 Glicerol: Pesamos 848mg de Glicerol en un matraz volumétrico de
20mL y llevamos a volumen con diluyente. De esta primera solución
transferimos 10mL a un matraz volumétrico de 20mL, completamos
a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.7 Sorbitol solución no cristalizante:   Pesamos 1880mg de sorbitol
solución no cristalizante en un matraz volumétrico de 20mL, luego
diluimos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.8 Propilenglicol: Se pesó 320mg de propilenglicol en un matraz
volumétrico de 20mL, diluimos a volumen con diluyente y
mezclamos. Asimismo, transferimos 5,0mL de esta primera
solución a un matraz volumétrico de 20mL, completamos a
volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.9 Ácido Cítrico anhidro: Pesamos 52mg de ácido cítrico anhidro en
un matraz volumétrico de 100mL, diluimos a volumen con diluyente
y mezclamos. Seguidamente, transferimos de la solución anterior
24
25mL y lo llevamos a un matraz volumétrico de 50mL, completamos
a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.10 Citrato de sodio dihidratado: Pesamos 40mg de citrato de sodio
dihidratado en un matraz volumétrico de 50mL, diluimos a volumen
con diluyente y mezclamos. De esta solución transferimos 1mL y
llevamos a un matraz volumétrico de 20mL, completamos a
volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.11 Sacarina Sódica Dihidratada: Pesamos 20mg de Sacarina sódica
dihidratada en un matraz volumétrico de 50mL, diluimos a volumen
con diluyente y mezclamos. Se transfirió 1mL de esta solución y se
llevó a un matraz volumétrico de 20mL, luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.12 Sabor granadilla: Medimos 0,465mL de sabor a granadilla en un
matraz volumétrico de 50mL, luego diluimos a volumen con
diluyente y mezclamos. Seguidamente transferimos 2mL de esta
solución y lo llevamos a un matraz volumétrico de 20mL,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.1.13 Placebo: Se preparó la muestra según el punto 2.5.7.4 detallado
anteriormente en el presente estudio.
2.5.8.2.1.14  Estándar mixto de Ambroxol Clorhidrato y Clenbuterol
Clorhidrato: Se preparó la solución estándar mixta según el punto
2.5.7.2 descrito con anterioridad en la presente investigación.
2.5.8.2.1.15 Solución Muestra: Se preparó la solución muestra según lo
establecido en el punto 2.5.7.3 descrito anteriormente en el
presente estudio.
Filtramos una porción de estas soluciones a través de la membrana de PVDF de
0.45µm hacia los viales HPLC, descartando los primeros tres mililitros. Luego
procedimos a realizar la corrida en el equipo HPLC colocando las muestras en
el orden que indica la siguiente tabla.
25
Tabla 4: Número de muestra y número de inyecciones-Especificidad por
Identificación
Muestras Nº de muestras Nº de inyecciones
Fase móvil 1 2
Agua 1 2
Buffer 1 2
Acetonitrilo 1 2
Metanol 1 2
Estándar mixto de Ambroxol y Clenbuterol 1 5
Estándar de Ambroxol Clorhidrato 2 2
Estándar de Clenbuterol Clorhidrato 2 2
Metilparabeno 2 2
Propilparabeno 2 2
Glicerol 2 2
Sorbitol solución no Cristalizante 2 2
Propilenglicol 2 2
Ácido cítrico Anhidro 2 2
Citrato de sodio Dihidratado 2 2
Sacarina Sódica Dihidratado 2 2
Sabor a Granadilla 2 2
Placebo 2 2
Estándar mixto de ambroxol y clenbuterol 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
2.5.8.2.2 Especificidad por degradación: Se realizó análisis individuales de
cada uno de los componentes de la fórmula: placebo, analito
(estándar mixto, estándar de ambroxol y estándar de clenbuterol) y
producto terminado (solución muestra).
2.5.8.2.2.1 Preparación de la muestra a CONDICIÓNES NORMALES:
2.5.8.2.2.1.1 Placebo: Pesamos 5,0mL de placebo (± 0,0mg Ambroxol
Clorhidrato y 0,0mg Clenbuterol Clorhidrato), exactamente
26
medidos, luego lo trasladamos a un matraz volumétrico de
25mL, diluimos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.2.2.1.2 Estándar mixto Ambroxol HCl y Clenbuterol HCl: Se preparó
la solución según el punto 2.5.7.2 antes mencionado en el
presente informe.
2.5.8.2.2.1.3 Solución estándar de Ambroxol Clorhidrato: Se preparó la
solución según el punto 2.5.7.5 antes mencionado en el
presente informe.
2.5.8.2.2.1.4 Solución estándar de Clenbuterol: Se preparó la solución
según el punto 2.5.7.6 antes mencionado en el presente
informe.
2.5.8.2.2.1.5 Solución muestra: Se preparó la solución según el punto
2.5.7.3 mencionado con anterioridad en el presente informe.
2.5.8.2.2.2 Preparación de la muestra sometida a degradación por
FOTÓLISIS:
2.5.8.2.2.2.1 Placebo:
2.5.8.2.2.2.1.1 Degradación por luz ultravioleta: Trasferimos 5,0mL de
placebo, exactamente medidos, a un matraz volumétrico de
25mL, lo cual sometimos a condiciones de degradación a
luz ultravioleta por un periodo de 24 horas. Seguidamente
continuamos la preparación de la solución placebo según
el punto 2.5.7.4 establecidos antes en la presente
investigación.
2.5.8.2.2.2.1.2 Degradación por luz natural: Transferimos 5,0mL de
placebo, exactamente medidos, a un matraz volumétrico de
25mL, luego lo sometimos a condiciones de degradación
por luz natural. Seguidamente continuamos la preparación
de la solución placebo según el punto 2.5.7.4 que fueron
descritos anteriormente en la presente investigación.
2.5.8.2.2.2.2 Estándar mixto ambroxol clorhidrato y clenbuterol clorhidrato:
2.5.8.2.2.2.2.1 Degradación por luz ultravioleta: Se transfirió 20mg de
Clenbuterol clorhidrato a un matraz volumétrico de 100mL,
y sometimos a exposición por la lampara UV (luz UV a
27
254nm) por 24 horas. Paralelamente transferimos
aproximadamente 30mg de Ambroxol clorhidrato a un
matraz volumétrico de 100mL, seguidamente sometimos a
exposición por lampara UV (luz UV a 254nm) por 24 horas,
ambas muestras. Luego continuamos la preparación de la
solución estándar según el método antes establecido en el
punto 2.5.7.2 de la presente investigación.
2.5.8.2.2.2.2.2 Degradación por luz natural: Transferimos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato a un matraz volumétrico de 100mL,
paralelamente transferimos 30mg de Ambroxol Clorhidrato
exactamente pesados a un matraz volumétrico de 100mL y
lo sometimos a exposición por luz natural por 24 horas,
ambas muestras. Luego del tiempo continuamos la
preparación de la solución estándar según la técnica antes
establecida en el punto 2.5.7.2 de la presente
investigación.
2.5.8.2.2.2.3 Solución de Ambroxol Clorhidrato:
2.5.8.2.2.2.3.1 Degradación por luz ultravioleta: Pesamos 15mg de
Ambroxol clorhidrato, colocamos en un matraz volumétrico
de 50mL y lo sometimos a exposición por lampara UV (luz
a 254nm) por 24 horas. Luego agregamos 20mL de
diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa y mezclamos.
2.5.8.2.2.2.3.2 Degradación por luz natural: Pesamos 15mg de Ambroxol
clorhidrato, colocamos en un matraz volumétrico de 50mL,
lo sometimos a exposición por luz natural por 24 horas.
Luego del tiempo indicado agregamos 20mL de diluyente y
sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa,
seguidamente lo llevamos a volumen y mezclamos.
2.5.8.2.2.2.4 Solución de Clenbuterol Clorhidrato:
2.5.8.2.2.2.4.1 Degradación por luz ultravioleta: Pesamos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato y colocamos en un matraz
volumétrico de 100mL, luego lo sometimos a exposición
por lampara UV (luz UV a 254nm) por 24 horas.
28
Seguidamente continuamos la preparación de la solución
estándar según el método antes detallado en el punto
2.5.7.6 de la presente investigación.
2.5.8.2.2.2.4.2 Degradación por luz natural: Pesamos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato y colocamos en un matraz
volumétrico de 100mL, y sometimos a exposición por luz
natural a 24 horas. Luego continuamos la preparación de
la solución estándar según el método establecido con
anterioridad en el punto 2.5.7.6 de la presente
investigación.
2.5.8.2.2.2.5 Solución muestra:
2.5.8.2.2.2.5.1 Degradación por luz Ultravioleta: Se transfirió 5,0mL de la
muestra a un matraz volumétrico de 25mL y sometimos a
exposición por lámpara UV (luz UV a 254nm) durante 24
horas. Luego continuamos la preparación de la solución
muestra según el método antes descrito en el punto 2.5.7.3
de la presente investigación.
2.5.8.2.2.2.5.2 Degradación por luz natural: Se transfirió 5,0mL de la
muestra a un matraz volumétrico de 25mL y sometimos a
exposición por luz natural durante 24 horas. Seguidamente
continuamos la preparación de la solución muestra según
el método antes detallado en el punto 2.5.7.3 de la presente
investigación.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales de HPLC, descartando los primeros
mililitros y se procedió a realizar la corrida en el cromatógrafo.
2.5.8.2.2.3 Preparación de muestra sometida a degradación por
TERMOLISIS.
2.5.8.2.2.3.1 Placebo: Transferimos 5,0mL de placebo a un matraz
volumétrico de 25mL, y lo colocamos en la estufa a 70ºC por
24 horas, continuamos la preparación de la solución placebo
29
según la técnica antes establecido en el punto 2.5.7.4 del
presente informe.
2.5.8.2.2.3.2 Estándar Mixto Ambroxol clorhidrato y Clenbuterol clorhidrato:
Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato, y colocamos en un
matraz volumétrico de 100mL, paralelamente pesamos 30mg
de Ambroxol clorhidrato y transferimos a un matraz
volumétrico de 100mL, seguidamente colocamos en la estufa
a 70ºC por 24 horas y luego esperamos que la muestra llegue
a temperatura ambiente. Posteriormente continuamos la
preparación de la solución estándar según el método
establecido con anterioridad en el punto 2.5.7.2 del presente
informe.
2.5.8.2.2.3.3 Solución de Ambroxol clorhidrato: Transferimos 15mg de
Ambroxol clorhidrato a un matraz volumétrico de 50mL, y
colocamos a la estufa a 70ºC por 24 horas. Luego esperamos
que la muestra llegue a temperatura ambiente. Seguidamente
agregamos 20mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos
hasta disolución completa, se llevó a volumen y mezclamos.
2.5.8.2.2.3.4 Solución de Clenbuterol clorhidrato: Transferimos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato a un matraz volumétrico de 100mL, y
colocamos en la estufa a 70ºC por 24 horas, luego de esto
esperamos que la muestra llegue a temperatura ambiente, y
posteriormente continuamos con la preparación de la solución
estándar según el método antes establecido en el punto
2.5.7.6 del presente informe.
2.5.8.2.2.3.5 Solución Muestra: Transferimos 5,0mL de solución muestra a
un matraz volumétrico de 25mL y colocamos en la estufa a
70ºC por 24 horas, luego se esperó que la muestra llegue a
temperatura ambiente y continuamos con la preparación de la
solución muestra siguiendo la técnica detallada anteriormente
en el punto 2.5.7.3 del presente informe.
30
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales de HPLC descartando los primeros
mililitros y se procedió a realizar la corrida en el equipo.
2.5.8.2.2.4 Preparación de la muestra sometida a degradación ÁCIDA:
2.5.8.2.2.4.1 Placebo: Transferimos 5,0mL de placebo a un matraz
volumétrico de 25mL, agregamos 1mL de Ácido clorhídrico 1N
y llevamos a baño María a una temperatura de 60ºC, por un
periodo de una hora. Pasado el tiempo retiramos y dejamos
enfriar a temperatura ambiente, neutralizamos adicionando
1mL de Hidróxido de sodio 1N, posterior a esto continuamos
la preparación de la solución placebo según la técnica
detallada antes en el punto 2.5.7.4 del presente estudio.
2.5.8.2.2.4.2 Estándar mixto Ambroxol clorhidrato y Clenbuterol clorhidrato:
Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato en un matraz
volumétrico de 100mL, paralelamente transferimos 30mg de
Ambroxol clorhidrato en un matraz volumétrico de 100mL,
agregamos 1mL de Ácido clorhídrico 1N, llevamos a baño
María a 60ºC durante una hora. Pasado el tiempo retiramos
la muestra y dejamos enfriar a temperatura ambiente,
neutralizamos adicionando 1mL de hidróxido de sodio 1N,
luego continuamos con la preparación de la solución estándar
según el método detallado antes en el punto 2.5.7.2 del
presente estudio.
2.5.8.2.2.4.3 Solución de Ambroxol Clorhidrato: Pesamos 15mg de
Ambroxol clorhidrato en un matraz volumétrico de 50mL y
agregamos 1mL de Ácido clorhídrico 1N, llevamos a baño
María a una temperatura de 60ºC durante una hora, pasado
el tiempo retiramos la muestra y dejamos enfriar a
temperatura ambiente, neutralizamos adicionando 1mL de
hidróxido de sodio 1N, luego agregamos 20mL de diluyente y
sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa,
seguidamente llevamos a volumen y mezclamos.
31
2.5.8.2.2.4.4 Solución de Clenbuterol Clorhidrato: Pesamos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato a un matraz volumétrico de 100mL,
agregamos 1mL de Ácido clorhídrico 1N llevamos a baño
María a una temperatura de 60ºC por una hora y dejamos
enfriar a temperatura ambiente. Pasado el tiempo
neutralizamos adicionando 1mL de hidróxido de sodio 1N.
Continuamos la preparación de la solución según el método
establecido antes en el punto 2.5.7.6 del presente estudio.
2.5.8.2.2.4.5 Solución Muestra: Transferimos 5,0mL de la muestra a un
matraz volumétrico de 25mL y agregamos 1mL de Ácido
clorhídrico 1N, luego llevamos a baño María a una
temperatura de 60ºC durante una hora, retiramos y dejamos
enfriar a temperatura ambiente, seguidamente neutralizamos
adicionando 1mL de hidróxido de sodio 1N y continuamos la
solución muestra según la técnica antes establecido en el
punto 2.5.73 del presente estudio.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales HPLC, descartando los primeros mililitros.
Seguidamente procedimos a realizar la corrida en el cromatógrafo.
2.5.8.2.2.5 Preparación de muestras sometidas a degradación
ALCALINA:
2.5.8.2.2.5.1 Placebo: Transferimos 5,0mL de placebo a un matraz
volumétrico de 25mL, agregamos 1mL de Hidróxido de sodio
1N y llevamos a baño María a una temperatura de 60ºC por
una hora, retiramos y dejamos enfriar a temperatura
ambiente; luego neutralizamos con la adición 1mL de Ácido
clorhídrico 1N. Seguidamente continuamos la preparación de
la solución placebo según el método antes establecido en el
punto 2.5.7.4 de la presente investigación.
2.5.8.2.2.5.2 Estándar mixto de Ambroxol clorhidrato y Clenbuterol
clorhidrato: Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, paralelamente pesamos 30mg
de Ambroxol clorhidrato en un matraz volumétrico de 100mL,
32
agregamos 1mL de hidróxido de sodio 1N, luego lo llevamos
a baño María a 60ºC por una hora. Pasado el tiempo retiramos
y dejamos enfriar a temperatura ambiente. Se neutralizó
adicionando 1mL de Ácido clorhídrico 1N y continuamos la
preparación de la solución estándar según el método antes
establecido en el punto 2.5.7.2 de la presente investigación.
2.5.8.2.2.5.3 Solución de Ambroxol clorhidrato: Pesamos 15mg de
Ambroxol clorhidrato en un matraz volumétrico de 50mL,
agregamos 1mL de Hidróxido de sodio 1N, lo llevamos a baño
María a una temperatura de 60ºC por una hora. Pasado el
tiempo retiramos y dejamos enfriar a temperatura ambiente,
neutralizamos adicionando 1mL de Ácido clorhídrico 1N.
Luego agregamos 20mL de diluyente y sonicamos por 5min
hasta la disolución completa, seguidamente lo llevamos a
volumen y mezclamos.
2.5.8.2.2.5.4 Solución de Clenbuterol clorhidrato: Pesamos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato en un matraz volumétrico de 100mL y
agregamos 1mL de Hidróxido de sodio 1N y lo llevamos a
baño María a una temperatura de 60ºC por una hora. Pasado
el tiempo retiramos y dejamos enfriar a temperatura ambiente.
Neutralizamos adicionando 1mL de Ácido clorhídrico 1 N y
continuamos la preparación de la solución estándar según el
método antes establecido en el punto 2.5.7.6 de la presente
investigación.
2.5.8.2.2.5.5 Solución Muestra: Transferimos 5,0mL de la muestra a un
matraz volumétrico de 25mL y agregamos 1mL de Hidróxido
de sodio 1N y lo llevamos a baño María a una temperatura de
60ºC por una hora. Transcurrido el tiempo retiramos y
dejamos enfriar a temperatura ambiente, luego neutralizamos
adicionando 1mL de Ácido Clorhídrico 1 N y continuamos la
preparación según el método antes establecido en el punto
2.5.7.3 de la presente investigación.
33
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales de HPLC, descartando los primeros
mililitros. Seguidamente procedimos a realizar la corrida en el equipo HPLC.
2.5.8.2.2.6 Preparación de muestras sometidas a degradación
OXIDATIVA
2.5.8.2.2.6.1 Placebo: Transferimos 5,0mL de placebo a un matraz
volumétrico de 25mL y lo protegimos de la luz, luego
agregamos 1mL de Peróxido de hidrógeno 30% dejándolo
reposar por una hora. Continuamos con la preparación de la
solución placebo según la técnica antes detallada en el punto
2.5.7.4 del presente informe.
2.5.8.2.2.6.2 Estándar misto de Ambroxol clorhidrato y Clenbuterol
clorhidrato: Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, paralelamente transferimos
30mg de Ambroxol clorhidrato en un matraz volumétrico de
100mL y lo protegimos de la luz, seguidamente agregamos
1mL de Peróxido de hidrógeno 30%, dejamos reposar por
durante una hora y continuamos la preparación de la solución
estándar según la técnica antes detallada en el punto 2.5.7.2
del presente informe.
2.5.8.2.2.6.3  Solución de Ambroxol clorhidrato: Pesamos 15mg de
Ambroxol clorhidrato en un matraz volumétrico de 50mL y lo
protegimos de la luz, luego agregamos 1mL de Peróxido de
hidrógeno al 30%, lo dejamos reposar por una hora,
seguidamente agregamos 20mL de diluyente y sonicamos por
5 minutos hasta disolución completa, luego llevamos a
volumen y mezclamos.
2.5.8.2.2.6.4 Solución de Clenbuterol Clorhidrato: Pesamos 20mg de
Clenbuterol clorhidrato en un matraz volumétrico de 100mL
protegido de la luz y agregamos 1mL de Peróxido de
hidrógeno 30%, luego dejamos reposar por una hora y
34
continuamos la preparación de la solución según la técnica
antes detallada en el punto 2.5.7.6 del presente informe.
2.5.8.2.2.6.5 Solución Muestra: Transferimos 5mL a un matraz volumétrico
de 25mL y lo protegimos de la luz, luego agregamos 1mL de
peróxido de hidrógeno 30%, dejamos reposar por una hora,
posterior a esto continuamos con la preparación de la muestra
según la técnica antes detallada en el punto 2.5.7.3 del
presente informe.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales HPLC, descartando los primeros mililitros.
Seguidamente procedimos a realizar la corrida en el cromatógrafo.
Table 5: Número de muestras y número de inyecciones-Especificidad por
Degradación
Tipo de Muestra Nº de Muestra Nº de
degradación Inyecciones
Placebo 2 2
Estándar mixto 2 2
Condiciones
Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
Normales
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
Placebo 2 2
Estándar mixto 2 2
Fotólisis por luz
Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
Ultravioleta
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
Placebo 2 2
Estándar mixto 2 2
Fotolisis por luz
Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
natural
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
Termólisis Placebo 2 2
35
Estándar mixto 2 2
Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
Placebo 2 2
Estándar mixto 2 2
Hidrólisis Ácida Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
Placebo 2 2
Estándar mixto 2 2
Hidrólisis Básica Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
Placebo 2 2
Estándar mixto 2 2
Hidrólisis
Solución de Ambroxol clorhidrato 2 2
Oxidativa
Solución de Clenbuterol clorhidrato 2 2
Muestra de producto terminado 2 2
2.5.8.3 Linealidad:
Capacidad que tienen los ensayos de obtener resultados
directamente proporcionales a la concentración del analito, dentro de
un rango determinado6. Este parámetro se divide en linealidad del
sistema y linealidad de método.
2.5.8.3.1 Linealidad de sistema: Se preparó tres series de cinco
concentraciones con un sistema de estándares al 80%, 90%, 100%,
110% y 120% analizados por triplicado.
2.5.8.3.1.1 Estándar al 80% (Concentración Clenbuterol HCl
0,00016mg/mL y Ambroxol HCl 0,24mg/mL):
36
2.5.8.3.1.1.1 Solución 1: Pesamos 16mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, luego
agregamos 30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos; para
finalmente completar a volumen con diluyente y mezclarlo.
Seguidamente transferimos 2,0mL de la solución anterior a un
matraz volumétrico de 100mL y completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.1.1.2 Solución 2: Pesamos 24mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, adicionamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa; posteriormente transferimos 5,0mL de la solución 1,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.1.2 Estándar al 90% (concentración de Clenbuterol HCl
0,00018mg/mL y Ambroxol HCl 0,27mg/mL):
2.5.8.3.1.2.1 Solución 1: Pesamos 18mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Seguidamente transferimos 2,0mL de la solución anterior a un
matraz volumétrico de 100mL, completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.1.2.2 Solución 2: Pesamos 27mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, adicionamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa; luego transferimos 5,0mL de la solución 1,
completamos a volumen y mezclamos.
2.5.8.3.1.3 Estándar al 100% (concentración Clenbuterol HCl
0,0002mg/mL y Ambroxol HCl 0,3mg/mL):
2.5.8.3.1.3.1 Solución 1: Pesar 20mg de Clenbuterol clorhidrato y colocamos
en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL de
diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos. Posteriormente
transferimos 2.0mL de la solución anterior a un matraz
37
volumétrico de 100mL, completamos a volumen con diluyente, y
mezclamos.
2.5.8.3.1.3.2 Solución 2: Pesamos 30mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa, luego transferimos 5,0mL de la solución 1, lo cual se
completó a volumen con diluyente, y se mezcló.
2.5.8.3.1.4 Estándar al 110% (concentración de Clenbuterol HCl
0,00022mg/mL y Ambroxol HCl 0,33mg/mL):
2.5.8.3.1.4.1 Solución 1: Pesamos 22mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Seguidamente transferimos 2.0mL de la solución anterior, a un
matraz volumétrico de 100mL, completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.1.4.2 Solución 2: Pesamos 33mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL; agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa, posteriormente transferimos 5,0mL de la solución 1,
completamos a volumen con diluyente, y mezclamos.
2.5.8.3.1.5 Estándar 120% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,00024mg/mL y Ambroxol HCL 0,36mg/mL):
2.5.8.3.1.5.1 Solución 1: Pesamos 24mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos; luego
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Seguidamente transferimos 2,0mL de la solución anterior a un
matraz volumétrico de 100mL completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.1.5.2 Solución 2: Transferimos 36mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
38
completa. Finalmente transferimos 5,0mL de la solución 1,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales HPLC, descartando los primeros mililitros.
Posteriormente se procedió a realizar la corrida en el equipo HPLC.
Tabla 6: Número de muestras y número de inyecciones-Linealidad
del Sistema
Serie 1
Muestra Nº de Muestra Nº de Inyección
Muestra al 80%: M1. Rep. 1 1 1
Muestra al 80%: M2. Rep. 1 1 1
Muestra al 80%: M3. Rep. 1 1 1
Muestra al 90%: M1. Rep. 1 1 1
Muestra al 90%: M2. Rep. 1 1 1
Muestra al 90%: M3. Rep. 1 1 1
Muestra al 100%: M1. Rep. 1 1 1
Muestra al 100%: M2. Rep. 1 1 1
Muestra al 100%: M3. Rep. 1 1 1
Muestra al 110%: M1. Rep. 1 1 1
Muestra al 110%: M2. Rep. 1 1 1
Muestra al 110%: M3. Rep. 1 1 1
Muestra al 120%: M1. Rep. 1 1 1
Muestra al 120%: M2. Rep. 1 1 1
Muestra al 120%: M3. Rep. 1 1 1
De igual forma se realizó la secuencia de la Serie 2, que inicia con la Muestra
al 80%: M1. Rep. 2… y termina en Muestra al 120%: M3. Rep. 2. Luego la
serie 3 que inicia con la muestra al 80%: M1. Rep. 3… y termina en muestra
al 120%: M3. Rep. 3
39
2.5.8.3.2 Linealidad de Método: El estudio se realizó con la adición del
placebo más una cantidad de analito al 80%, 90%, 100%,110% y
120% preparándose muestras por triplicado.
2.5.8.3.2.1 Solución estándar mixto: Se preparó la solución estándar
según lo establecido con anterioridad en el punto 2.5.7.2 del
presente estudio.
2.5.8.3.2.2 Analito al 80% (Concentración de Clenbuterol
0,00016mg/mL y Ambroxol HCl 0,24mg/mL):
2.5.8.3.2.2.1 Solución 1: Pesamos 16mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego se
completó a volumen con diluyente y mezclamos.
Posteriormente transferimos 2,0mL de la solución anterior a un
matraz volumétrico de 100mL donde completamos a volumen
con diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.2.2.2 Solución 2: Pesamos 24mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz de 100mL, agregamos 30mL de
diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa,
luego añadimos 20mL de placebo y 5mL de la solución 1,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.2.3 Analito al 90% (Concentración Clenbuterol HCl
0,00018mg/mL y Ambroxol HCl 0,0,27mg/mL):
2.5.8.3.2.3.1 Solución 1: Pesamos 18mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos, se completó a
volumen y mezclamos. Seguidamente transferimos 2,0mL de
la solución anterior, a un matraz volumétrico de 100mL donde
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.2.3.2 Solución 2: Pesamos 27mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, adicionamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa; luego añadimos 20mL de placebo y 5,0mL de la
solución 1, seguido completamos a volumen con diluyente y
mezclamos.
40
2.5.8.3.2.4 Analito al 100% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,0002mg/mL y Ambroxol HCl 0,3mg/mL):
2.5.8.3.2.4.1 Solución 1: Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego se
completó a volumen con diluyente y se mezcló. Transferimos
2,0mL de la solución anterior a un matraz volumétrico de
100mL, seguidamente completamos a volumen con diluyente y
mezclamos.
2.5.8.3.2.4.2 Solución 2: Transferimos 30mg de Ambroxol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos
30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución
completa, después añadimos 20mL de placebo y 5,0mL de la
solución 1, completamos a volumen con diluyente y
mezclamos.
2.5.8.3.2.5 Analito al 110% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,00022mg/mL y Ambroxol HCl 0,33mg/mL):
2.5.8.3.2.5.1 Solución 1: Pesamos 22mg de Clenbuterol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL de diluyente y
sonicamos por 5 minutos, completamos a volumen con
diluyente y mezclamos. Luego transferimos 2,0mL de la
solución anterior a un matraz volumétrico de 100mL, después
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.2.5.2 Solución 2: Pesamos 33mg de Ambroxol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, adicionamos 30mL de diluyente
y sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa;
posteriormente añadimos 20mL de placebo y 5,0mL de la
solución 1, completamos a volumen con diluyente y
mezclamos.
2.5.8.3.2.6 Analito al 120% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,00024mg/mL y Ambroxol HCl 0,36mg/mL):
2.5.8.3.2.6.1 Solución 1: Pesamos 24mg de Clenbuterol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL de diluyente y
sonicamos por 5 minutos, luego completamos a volumen con
41
diluyente y mezclamos. Posterior a ello transferimos 2,0mL de
la solución anterior a un matraz volumétrico de 100mL donde
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.3.2.6.2 Solución 2: Pesamos 36mg de Ambroxol Clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, adicionamos 30mL de diluyente
y sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa; después
añadimos 20mL de placebo y 5,0mL de la solución 1,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales del HPLC, descartamos los primeros
mililitros. Seguidamente se procedió a realizar la corrida en el equipo HPLC.
Tabla 7: Número de muestras y número de inyecciones-Linealidad del
Método
Muestra Nº de muestra Nº de inyección
Estándar Mixto 1 5
Muestra al 80% 3 3
Muestra al 90% 3 3
Muestra al 100% 3 3
Muestra al 110% 3 3
Muestra al 120% 3 3
2.5.8.4 Exactitud de Método:
Nivel de concordancia entre el valor real y el valor medido6.Este
estudio se realizó con adición del placebo más una cantidad del
conocido analito al 80%, 100% y 120%. Se preparó muestras por
triplicado.
2.5.8.4.1 Solución mixta: Se preparó la solución estándar según lo
detallado antes en el punto 2.5.7.2 del presente estudio.
2.5.8.4.2 Analito al 80% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,00016mg/mL y Ambroxol HCl 0,24mg/mL):
42
2.5.8.4.2.1 Solución 1: Pesamos 16mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL
de diluyente y sonicamos por 5 minutos; luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos. Seguidamente transferimos
2,0mL de la solución anterior a un matraz volumétrico de 100mL
donde se completó a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.4.2.2 Solución 2: Pesamos 24mg de Ambroxol clorhidrato y colocamos
en un matraz volumétrico de 100mL, después agregamos 20mL
de placebo, adicionamos 30mL de diluyente y sonicamos por 5
minutos hasta disolución completa, luego transferimos 5mL de la
solución 1, completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.4.3 Analito al 100% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,0002mg/mL y Ambroxol HCl 0,3mg/mL):
2.5.8.4.3.1 Solución 1: Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato y
colocamos en un matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL
de diluyente y sonicamos por 5 minutos; luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos. Como siguiente paso
transferimos 2,0mL de la solución anterior a un matraz
volumétrico de 100mL, donde completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.4.3.2 Solución 2: Pesamos 30mg de Ambroxol clorhidrato y colocamos
en un matraz volumétrico de 100mL, luego agregamos 20mL de
placebo, añadimos 30mL de diluyente y sonicamos por 5 minutos
hasta disolución completa. Seguidamente transferimos 5,0mL de
la solución 1, completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.4.4 Analito al 120% (Concentración de Clenbuterol HCL
0,00024mg/mL y Ambroxol HCl 0,36mg/mL)
2.5.8.4.4.1 Solución 1: Pesamos 24mg de Clenbuterol clorhidrato y lo
colocamos a un matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL
de diluyente y sonicamos por 5 minutos; luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos. Seguido a ello transferimos
2,0mL de la solución anterior a un matraz volumétrico de 100mL,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
43
2.5.8.4.4.2 Solución 2: Pesamos 36mg de Ambroxol clorhidrato y colocamos
en un matraz volumétrico de 100mL; agregamos 20mL de
placebo, adicionamos 30mL de diluyente y sonicamos por 5
minutos hasta disolución completa, luego transferimos 5,0mL de
la solución 1, completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales de HPLC, descartando los primeros mililitros
y se procedió a realizar la corrida en el equipo HPLC.
Tabla 8: Número de muestras y número de inyecciones-Exactitud
Muestra Nº de Muestra Nº de Inyecciones
Estándar Mixto 1 5
Muestra al 80% 3 3
Muestra al 100% 3 3
Muestra al 120% 3 3
2.5.8.5 Precisión del Método:
Capacidad del método de medir el grado de concordancia entre los
resultados individuales cuando el procedimiento se aplica
repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. En
este parámetro se considera en tres niveles: repetibilidad (precisión
bajo las mismas condiciones operativas durante periodo corto de
tiempo), precisión intermedia (dentro de las variaciones del
laboratorio: días diferentes, diferente analista y equipo diferentes)5.
2.5.8.5.1 Repetibilidad: En el procedimiento se aplicó añadiendo una
concentración al 100% de analito y placebo, se preparó muestras
por sextuplicado, se comparó con un estándar.
2.5.8.5.1.1 Solución estándar mixta: Preparamos la solución estándar
según lo establecido previamente en el punto 2.5.7.2. del presente
estudio.
2.5.8.5.1.2 Analito al 100%: (Concentración de Clenbuterol HCl
0,0002mg/mL y Ambroxol HCl 0,3mg/mL)
44
2.5.8.5.1.2.1 Solución 1: Pesamos 20mg de Clenbuterol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100ml, agregamos 30mL de diluyente y
sonicamos por 5 minutos; luego completamos a volumen con
diluyente y mezclamos. Seguidamente se procedió a transferir
2,0mL de la solución anterior a un matraz volumétrico de
100mL, después completamos a volumen y mezclamos.
2.5.8.5.1.2.2 Solución 2: Pesamos 30mg de Ambroxol clorhidrato en un
matraz volumétrico de 100mL, adicionamos 30mL de diluyente
y sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa, luego
añadimos 20mL de placebo y 5,0mL de la solución 1,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana de
PVDF de 0.45µm hacia los viales HPLC, descartamos los primeros mililitros.
Paso seguido se procedió a realizar la corrida en el equipo HPLC.
Tabla  9: Número de muestra y número de inyecciones – P.
Repetibilidad
Muestra Nº de Muestra Nº de inyección
Estándar mixto 1 5
Muestra al 100% 6 2
2.5.8.5.2 Precisión intermedia: Realizamos el procedimiento con el
producto terminado, donde preparamos muestras por sextuplicado,
y se comparó con el estándar, tanto para diferentes analistas como
para diferentes equipos.
2.5.8.5.2.1 Solución estándar mixto: Preparamos la solución estándar
según lo establecido previamente en el punto 2.5.7.2 del
presente informe.
2.5.8.5.2.2 Muestra: Transferimos 5,0mL de la muestra a un matraz
volumétrico de 25mL, diluimos a volumen con diluyente y
mezclamos.
45
Filtramos una porción de cada solución final a través de la membrana PVDF
de 0.45µm hacia los viales HPLC, descartando los primeros mililitros y
seguidamente se procedió a realizar la corrida en el cromatógrafo.
Tabla 10: Número de muestra y número de inyecciones-P.I. Diferente Analista
Tipo Muestra Nº de Muestra Nº de Inyecciones
Diferente analista  Estándar mixto 1 5
Muestra al 100% 6 2
Tabla  11: Número de muestra número de inyecciones-P.I. Diferente Equipo
Tipo Muestra Nº de Muestra Nº de Inyecciones
Diferentes equipos Estándar mixto 1 5
Muestra al 100% 6 2
2.5.8.6   Límite de Detección y Cuantificación:
El límite de detección comprende la cantidad mínima de un analito
que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada. El
límite de cuantificación estima la concentración mínima del analito en
una muestra que puede ser determinada con precisión y exactitud
aceptable5. En nuestra investigación se aplicó el método por
extrapolación a concentración cero, de muestras conteniendo bajas
concentraciones del analito.
Preparamos soluciones para cuatro concentraciones por duplicado
dentro del intervalo de 12,5% al 75% de las concentraciones de
trabajo.
2.5.8.6.1 Solución estándar mixto: Preparamos el estándar según lo
previamente detallado en el 2.5.7.2 del presente trabajo.
2.5.8.6.2 Solución al 12,5 (Concentración de Clenbuterol HCl
0,000025mg/mL y Ambroxol HCl 0,0375mg/mL)
2.5.8.6.2.1 Solución 1: Transferimos aproximadamente 25mg de
Clenbuterol clorhidrato RS, los cuales fueron pesados
exactamente y colocados en un matraz volumétrico de 100mL,
46
se agregó 30mL de diluyente y sonicamos por 5minutos, se
completó a volumen con diluyente y mezclamos. De la solución
anterior transferimos 1,0mL exactamente medido a un matraz
volumétrico de 10mL y se completó a volumen con el diluyente.
2.5.8.6.2.2 Solución 2: Transferimos aproximadamente 37,5mg de
Ambroxol clorhidrato RS, que fueron pesados y colocados en un
matraz volumétrico de 10mL, luego adicionamos 5mL del
diluyente y sonicamos por 5 minutos hasta disolución completa,
seguido completamos a volumen con diluyente y mezclamos. De
esta solución se transfirió 1,0mL a un matraz volumétrico de
100mL, añadimos 20mL de placebo y 5mL de la solución 1,
después completamos a volumen con diluyente y se mezclamos.
2.5.8.6.3 Solución al 25% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,00005mg/mL y Ambroxol HCl 0,075mg/mL)
2.5.8.6.3.1 Solución 1: Se transfirió 25mg de Clenbuterol clorhidrato RS a
un matraz volumétrico de 50mL, agregamos 20mL de diluyente
y sonicamos por 5 minutos, luego completamos con diluyente y
mezclamos. Seguidamente se procedió a trasferir 2,0mL de la
solución anterior a un matraz volumétrico de 100mL, donde
completamos con diluyente y mezclamos. De la solución anterior
transferimos 1,0mL a un matraz volumétrico de 10mL,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.6.3.2 Solución 2: Transferimos 75mg de Ambroxol clorhidrato RS a
un matraz volumétrico de 10mL, adicionamos 5mL de diluyente,
sonicamos por 5 minutos, luego completamos a volumen con
diluyente y mezclamos. Seguidamente transferimos 1,0mL, de la
solución anterior a un matraz volumétrico de 100mL, añadimos
20mL de placebo y 5,0mL de la solución 1, completamos a
volumen con diluyente y mezclamos.
47
2.5.8.6.4 Solución al 50% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,0001mg/mL y Ambroxol HCl 0,15mg/mL)
2.5.8.6.4.1 Solución 1: Transferimos 20mg de Clenbuterol clorhidrato RS,
a un matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL de
diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos. De la solución anterior
transferimos 2,0mL a un matraz volumétrico de 100mL,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.6.4.2 Solución 2: Transferimos 15mg de Ambroxol clorhidrato RS a
un matraz volumétrico de 100mL, adicionamos 5mL de
diluyente, sonicamos por 5 minutos, luego añadimos 20mL del
placebo y 5,0mL de la solución 1, completamos a volumen con
diluyente y mezclamos.
2.5.8.6.5 Solución al 75% (Concentración de Clenbuterol HCl
0,00015mg/mL y Ambroxol HCl 0,225mg/mL)
2.5.8.6.5.1 Solución 1: Transferimos 15mg de Clenbuterol clorhidrato RS,
a un matraz volumétrico de 100mL, agregamos 30mL de
diluyente y sonicamos por 5 minutos, luego completamos a
volumen con diluyente y mezclamos. De esta solución
transferimos 1,0mL a un matraz volumétrico de 50mL,
completamos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.6.5.2 Solución 2: Transferimos 22,5mg de Ambroxol clorhidrato RS,
a un matraz volumétrico de 100mL, adicionamos 5mL de
diluyente, sonicamos por 5 minutos, seguidamente añadimos
20mL de placebo y 5,0mL de la solución 1, completamos a
volumen con diluyente y mezclamos.
48
Tabla 12: Número de muestras y número de inyecciones-Límite de
Detección y Cuantificación
Muestras Nº de muestras Nº de Inyecciones
Estándar mixto 1 5
Muestra al 12,5% 2 2
Muestra al 25% 2 2
Muestra al 50% 2 2
Muestra al 75% 2 2
2.5.8.7 Robustez:
Este parámetro tiene la capacidad en el procedimiento de producir
resultados analíticos con exactitud y precisión aceptables bajo
variadas condiciones establecidas6. Se analizó la muestra al 100%
de la concentración en las siguientes condiciones:
2.5.8.7.1 Preparación del estándar mixto en condiciones normales:
Se preparó la solución estándar mixto según lo establecido
previamente en el punto 2.5.7.2 de la presente investigación.
2.5.8.7.2 Preparación de la muestra a condiciones normales
Transferimos 5,0mL de muestra (±0,0002 de Clenbuterol
clorhidrato y 0,3mg de Ambroxol clorhidrato) a un matraz de
25mL, luego diluimos a volumen con diluyente y mezclamos.
2.5.8.7.3 Variación del pH de la fase móvil:
Pasamos de una proporción de fase móvil, buffer pH 3.0:
Acetonitrilo: Metanol (60:18:22) a una proporción buffer pH 2.8:
Acetonitrilo: Metanol (60:18:22) y buffer pH 3.2: Acetonitrilo:
Metanol (60:18:22).
2.5.8.7.4 Condiciones de almacenamiento
Las muestras estuvieron a 24 horas TºC normal, a 24 horas en
refrigeración, muestras a 48 horas a TºC normal, a 48 horas en
refrigeración.
49
Filtramos una porción de la solución a través de la membrana de PVDF de
0,45µm descartando los primeros mililitros del filtrado y procedimos a la
corrida en el equipo HPLC.
Tabla 13: Número de muestras y número de inyecciones-Robustez
Variación en metodología Muestras Nº de muestras Nº de Inyecciones
Condición normal Estándar mixto 1 5
Muestras 2 2
Variación del pH de la fase Estándar mixto 1 5
móvil:
Buffer Muestras 2 2
pH2.8: Acetonitrilo
Metanol (60:18:22)
Condiciones de Estándar mixto 1 5
almacenamiento:
Muestras a 24 horas a TºC Muestras 2 2
ambiente y en
refrigeración.
Condiciones de Estándar mixto 1 5
almacenamiento:
Muestras a 48 horas de Muestras 2 2
TºC ambiente y en
refrigeración.
2.5.8.8 Rango:
Este parámetro permite la comprensión entre las concentraciones
superiores e inferiores del analito, donde aplicando el procedimiento
se demuestra que el analito es cuantificado con un nivel satisfactorio
de precisión, exactitud y linealidad5. En nuestra investigación se
tomó los datos de concentración más bajos y más altos obtenidos en
50
Exactitud y Linealidad con el cual se definió el rango que coincide
con estos parámetros.
2.6. Procesamiento de análisis estadísticos
Los datos recolectados fueron usados para el análisis estadístico, donde se
vació en el sistema Excel, siendo los cuadros adaptables y de manera
entendible con lo cual se procedió a la evaluación de cada parámetro. También
se utilizó el formato Minitab 18 como ayuda comparativa en la evaluación.
Entre los cálculos estadísticos para los parámetros de desempeño en la
validación de la técnica analítica para la identificación y cuantificación por
cromatografía líquida de alta resolución de ambroxol clorhidrato 7,5mg +
clenbuterol 0,005mg/5mL en jarabe se utilizaron los siguientes:
o En la Aptitud del sistema: Aplicamos el porcentaje de Desviación Estándar
Relativa (RSD%) o conocido también como Coeficiente de Variación (CV).
CV% = S x 100
ẋ
o En la Especificidad: Aplicamos el porcentaje de interferencia entre picos de
los excipientes y analitos, los cuales deben cumplir que los picos de
excipientes o sustancias producidas por la degradación no interfieran con
el pico del analito o que estos sean ≤2%, asimismo estos picos deben estar
claramente identificados.
o En la Linealidad: Se aplicó para este parámetro la prueba estadística de
coeficiente de correlación (r), coeficiente de determinación (r2) donde
criterio de aceptación debe ser r≥0,995 y r2≥0,990. El Test t de Student de
verificación de la pendiente “b” o test de linealidad, test estadístico donde
el criterio aceptable es t(experimental) > t(tablas), la prueba es conforme si
se rechaza la hipótesis nula (H0: b=0), también debe concluir que
estadísticamente la pendiente es significativamente diferente de cero y el
intervalo de confianza no debe incluir a cero. Test t de Student de
51
proporcionalidad o de verificación de la variable independiente “a”
(intercepto), donde el criterio de aceptación indica que el t(tablas) >
t(experimental), la prueba es conforme si no se rechaza la hipótesis nula
(H0: a=0), para ello debe evidenciar que estadísticamente el intercepto es
significativamente igual a cero y el intervalo de confianza debe incluir a
cero. Test t Student del coeficiente de correlación (r), este test rechaza la
hipótesis nula (H0: r=0), para ello la prueba debe evidenciar que el
coeficiente de correlación es significativamente diferente de cero y
t(experimental) > t(tablas), para n-2 grados de libertad y nivel de
significancia 0,05. Test de normalidad de residuales (y - y’), los residuales
respecto al eje deben cumplir la hipótesis de distribución normal.
Para la evaluación estadística de los resultados de la linealidad se usó las
siguientes ecuaciones:
- Ecuación de la recta:   y = bx + a
- Coeficiente de correlación (r)
= Ʃ −Ʃ Ʃ
( Ʃ 2 − Ʃ )2 ( Ʃ 2 −(Ʃ )2)
- Test de la verificación de la pendiente b o de la linealidad
· Varianza residual (S2y, x):
· Varianza de la pendiente (S2b)
· Desviación estándar de la pendiente (Sb)
2
52
            Sb=
· Desviación estándar relativa de la pendiente Sb rel (%)
· Límites de confianza de la pendiente
b   + tSb
· Test de t Student
 texp =  b
Sb
- Test de verificación de la variable independiente(intercepto) o de
proporcionalidad a.
· Varianza del término independiente(S2a)
· Desviación estándar del término independiente (Sa)
= 2
· Desviación estándar relativa del término independiente
· Límites de confianza del término independiente
a + tSa
· Test de t Student
 texp=    a
 Sa
- Test estadístico de correlación (r)
Para H0: r=0; H1: r=1; (n-2) grados de libertad
− 2
=
1 − 2
53
- Prueba de normalidad de residuales de linealidad, aplicamos la prueba de
hipótesis: donde la hipótesis nula(H0): Los residuales tienen distribución
normal y la Hipótesis alternativa (HA): Los residuales no tienen distribución
normal. El nivel de significancia a=0.05 y si p-value<0.05, se rechaza la
hipótesis nula.
o En la Exactitud: Aplicamos el porcentaje de recuperación, prueba estadística
donde el criterio de aceptación es de 98% a 102%. Asimismo, el coeficiente
de variación (CV) o Desviación Estándar Relativa (RSD%), el cual el valor
aceptable es ≤ 2%; Test t de Student (para n-1 grados de libertad y p=0,5)
donde debe cumplir que el t(experimental) < t(tablas). Para estos cálculos se
emplea las siguientes ecuaciones:
- Porcentaje de recuperación(%R):
  %R = (mg analito hallado) x 100
             (mg analito añadido)
- Coeficiente de Variación (CV) o Desviación relativa estándar (RSD%)
CV% = S x 100
ẋ
- T de Student
o En la Precisión del método: Aplicamos la Desviación Estándar Relativa
(RSD%) o Coeficiente de variación (CV), donde no debe ser mayor al 2%
para estándares en inyecciones repetidas. La aptitud del sistema que
anteriormente se ha calculado. La Prueba de Normalidad (Anderson
Darling), donde los resultados de cada secuencia deben cumplir la hipótesis
de distribución normal. La Prueba de Igualdad de Varianzas (Prueba F y
prueba de Bartlett), donde el resultado de comparación de secuencias de
igualdad de varianzas es aceptable de acuerdo al resultado final de la
prueba de medias, y se considera que, si p-value > 0.05, no se rechaza la
hipótesis nula y se considera que estadísticamente las varianzas son
54
iguales. La Prueba de medias: Análisis de varianza (ANOVA) y t de 2
muestras, donde se realiza por diferentes equipos y analistas, por el
método de ANOVA (Analysis Of Variance) para tres grupos de muestras o
más y t de dos muestras para comparación de dos grupos; para ello se
debe aceptar la hipótesis nula (H0: las medias de los grupos son iguales) y
si p-value es > 0,5 entonces se considera el resultado conforme.
Agrupación por el método de Games – Howel y el método de Tukey, esta
prueba estadística se aplica a 3 o más grupo de muestras, la prueba es
conforme si los grupos de muestras tienen la misma agrupación. Asimismo,
se halla y registra el Límite de confianza de los resultados individuales y
límite de confianza de los resultados promedios.
Los cálculos emplean las siguientes ecuaciones y condiciones:
- Coeficiente de variación (CV) o Desviación Estándar Relativa (RSD%)
CV% = S x 100
ẋ
- Prueba de normalidad:
Prueba de hipótesis: Hipótesis nula (H0) e Hipótesis alternativa (HA).
H0: Los datos tienen distribución normal
HA: Los datos no tienen distribución normal
Nivel de significancia a= 0.05
Si p-value < 0.05, se rechaza la hipótesis nula.
- Prueba de igualdad de varianzas:
Prueba de hipótesis:
H0= Todas las varianzas son iguales
HA= Al menos alguna varianza es diferente
Nivel de significancia es a= 0.05
Si p-value < 0.05; se rechaza la hipótesis nula.
- Prueba de Análisis de varianza (ANOVA)
Prueba de hipótesis:
H0: La media de los equipos son iguales
HA: la media de los equipos es estadísticamente diferentes
55
Nivel de significancia a= 0.05
Si p-value < 0.05, se rechaza la hipótesis nula.
- Límite de confianza de los resultados individuales
 ±
- Límite de confianza de los resultados promedios
 ± /√
o Para Límite de cuantificación y detección: La prueba estadística que
aplicamos fue el coeficiente de correlación (r) con criterio de aceptación es
≥ 0,995 y coeficiente de determinación (r2) donde el criterio de aceptación es
≥ 0,990. Las ecuaciones que se utilizan para estos cálculos son:
- Límite de detección:
- Límite de Cuantificación:
o Para robustez: Aplicamos el promedio(Ẋ), CV, calculamos el porcentaje de
alteración, donde el criterio de aceptación es ≤ 2%.
Las ecuaciones calculadas fueron:
- mg del analito encontrado:
mg analito hallado = Amp x Fst x Fmp
                Ast
Fst = wst     x   Pot.St
          100         100
           Fmp = 25   x    5
                    Vmp
- Porcentaje del analito (%p.a.)
56
%p.a.= mg analito hallado   x 100
             mg analito añadido
- Porcentaje de alteración
%alteración = 1%p.a. normal - %p.a. alterado
o Para rango: Se tomó los datos de concentración más bajos y más altos
obtenidos en Exactitud y Linealidad; y luego al comparar definiremos si el
rango coincide con este parámetro.
2.7. Aspectos éticos
De acuerdo a la investigación detallada anteriormente y siguiendo las normas
éticas, se considera el principio de no maleficencia, donde lo primordial es no
causar daño. Bajo este principio damos fe de no haber perjudicado ni afectado
en ninguna circunstancia al medio ambiente. En ese sentido, los desechos de
sustancias y materiales orgánicos utilizados en el presente trabajo siguen los
criterios de protocolo de bioseguridad de laboratorios S.J. Roxfarma para la
eliminación de estos.17
57
III. RESULTADOS
Al realizar los procedimientos de Validación se obtuvieron los siguientes resultados:
3.1.  Aptitud del sistema
Tabla 14: Evaluación de los resultados de la aptitud de sistema
cromatográfico de Ambroxol
Parámetro Límites Resultados
Aptitud del Sistema Áreas Estándar 1: 0.08%
CV ≤ 2.0% Estándar 2: 0.09%
Tiempos de Retención(min) Estándar 1: 0.63%
CV ≤ 2.0% Estándar 2: 0.06%
Asimetría Estándar 1: 1.69
< 2.0 Estándar 2: 1.70
Platos teóricos Estándar 1: 19363.7
> 1000 Estándar 2: 19136.5
Tabla 15: Resultados de la aptitud del sistema cromatográfico de Ambroxol.
Estándar 1 Estándar 2
Inyección Áreas Tiempo Asimetría Platos Áreas Tiempo Asimetría Platos
de teóricos de teóricos
Retención Retención
(min) (min)
1 118.2137 42.450 1.6850 19364 118.8056 42,400 1.7058 19158
2 118.3111 42.443 1.6774 19294 118.7309 42.416 1.7056 19230
3 118.3341 42.450 1.6882 19398 118.7475 42.408 1.7096 19185
4 118.3373 42.436 1.6855 19544 118.6410 42.368 1.7089 19219
5 118.3572 42.405 1.6942 19362 118.8068 42.425 1.6803 19006
6 118.2771 42.375 1.7059 19220 118.9456 42.435 1.6938 19021
Promedio 118.2771 42.426 1.6893 19363 118.7796 42.408 1.7021 19136
CV% 0.08 0.63 0.58 0.56 0.09 0.06 0.50 0.52
58
Tabla 16: Evaluación de los resultados de la aptitud del sistema
cromatográfico de Clenbuterol
Parámetro Límites Resultados
Aptitud del sistema Áreas Estándar 1: 0.13%
CV ≤ 2% Estándar 2: 0.26%
Tiempos de Estándar 1: 0.39%
Retención(min) Estándar 2: 0.06%
CV ≤ 2%
Asimetría Estándar 1: 1.15
< 2.0 Estándar 2: 1.16
Platos teóricos Estándar 1: 15992.8
>1000 Estándar 2: 16215.8
Tabla 17: Resultados de la aptitud del sistema cromatográfico de Clenbuterol.
Estándar 1 Estándar 2
Nº Áreas Tiempos Asimetría Platos Áreas Tiempos Asimetría Platos
Inyección de teóricos de teóricos
retención retención
(min) (min)
1 2.4115 22.142 1.1504 16197 2.3978 22.112 1.1386 16187
2 2.4117 22.133 1.1443 16152 2.3986 22.132 1.1479 16302
3 2.4148 22.142 1.1448 16173 2.3918 22.135 1.1557 16318
4 2.4116 22.142 1.1408 15565 2.3832 22.100 1.1665 16236
5 2.4109 22.110 1.1594 15748 2.3954 22.120 1.1749 16315
6 2.4189 22.100 1.1600 16122 2.4001 22.128 1.1542 15937
Promedio 2.4132 22.128 1.1499 15992 2.3945 22.121 1.1563 16215
CV% 0.13 0.39 0.71 1.68 0.26 0.06 1.12 0.90
59
3.2  Especificidad
3.2.1  Especificidad por Identificación:
Tabla 18: Evaluación de los resultados de Especificidad por identificación.
Parámetro Límites Resultado
Especificidad por Ambroxol Clenbuterol
identificación
Soluciones de la fase - No hay No hay
móvil: interferencia con interferencia
(agua, metanol, fase el  pico  de
móvil) Ambroxol HCL.
- No hay No hay
interferencia con interferencia
el  pico  de
Clenbuterol HCL
Componentes de la
fórmula:
Ø Estándar mixto - Se identifican (+) Tiempo de (+) Tiempo de
picos para retención :47.4 min. retención: 22.9
Ambroxol  HCl  y min.
Clenbuterol HCl.
Ø Analito:
     Ambroxol HCl - Se identifican los (+) Tiempo de
picos de retención:47.4 min.
Ambroxol HCl.
Clenbuterol HCl. - Se identifica (+) Tiempo de
picos de retención: 22.9
Clenbuterol HCl. min.
Ø Otros:
Metilparabeno, - No hay No hay
propilparabeno, interferencia con interferencia.
glicerol, sorbitol,
60
propilenglicol, ácido el  pico  de
cítrico, citrato de Ambroxol HCL.
sodio, sacarina No hay
sódica, alcohol - No hay interferencia.
bencílico, sabor interferencia con
granadilla. el  pico  de
Clenbuterol HCl.
Soluciones de trabajo:
Ø Estándar Mixto - Se identifican los
Ambroxol HCl picos de Ambroxol (+) Tiempo de
HCl y Clenbuterol retención: 47.7 min.
Clenbuterol HCl HCl. (+) Tiempo de
retención: 23.1
min.
ØProducto terminado: - No hay No hay
(Ácido cítrico, sacarina interferencia para interferencia.
sódica, sabor granadilla, el  pico  de (+) Tiempo de
propilparabeno, Ambroxol HCl. retención: 47.7 min.
metilparabeno,
ambroxol HCl, - No hay No hay
clenbuterol HCl). interferencia para interferencia.
el  pico  de (+) Tiempo de
Clenbuterol HCl. retención: 23.0
min.
Placebo:
(Ácido cítrico, sacarina - No hay No hay
sódica, sabor granadilla, interferencia con interferencia.
propilparabeno, el  pico  de
metilparabeno, ambroxol Ambroxol HCl.
HCl, clenbuterol HCl ). - No hay presencia Tiempo de
del pico de retención:   -
Ambroxol HCl por
ser placebo.
61
- No hay No hay
interferencia con interferencia.
el  pico  de
Clenbuterol HCl.
- No hay presencia Tiempo de
de pico de retención:   -
clenbuterol HCl
por ser placebo.
3.2.2  Especificidad por Degradación:
Tabla 19: Evaluación de resultados de Especificidad por Degradación
Parámetro Límites Resultados
Especificidad
Por Ambroxol Clenbuterol
Degradación
Condición Placebo Analito Producto Placebo Analito Producto
terminado terminado
Normal ≤ 2.0% 0.0% 0.8% 0.1% 0.0% 1.7% 0.6%
Hidrólisis ≤ 2.0% 0.0% 1.3% 1.0% 0.0% 24.4% 3.5%
ácida
Hidrólisis ≤ 2.0% 0.0% 0.4% 0.6% 0.0% 5.7% 5.1%
básica
Oxidativa ≤ 2.0% 0.0% 79.2% 0.6% 0.0% 31.2% 0.5%
Termólisis ≤ 2.0% 0.0% 0.5% 0.2% 0.0% 1.8% 1.3%
Fotólisis ≤ 2.0% 0.0% 0.6% 0.5% 0.0% 8.2% 0.5%
UV. 24 horas
Fotólisis ≤ 2.0% 0.0% 0.9% 0.7% 0.0% 8.9% 7.4%
Luz natural 24
horas
62
Tabla 20: Resultados de Especificidad por degradación de Ambroxol.
63
64
Tabla 21: Resultados de Especificidad por degradación de Clenbuterol.
65
66
3.3  Linealidad
3.3.1 Linealidad del sistema
Tabla 22: Evaluación de Resultados de la Linealidad del Sistema
Parámetro Límites Resultados
Linealidad de sistema Serie 1 Serie 2 Serie 3
- Ecuación de la recta y=bx + a A: A: A:
y=384.1040X y=382.7548X y=387.0380X
+ (2.3593) + (2.7720) + (1.5807)
C: C: C:
y=11690.60X y=11626.18X Y=11700.29X
+ (0.0051) +(0.0507) + (0.0313)
A: 0.9997 A: 0.9993 A: 0.9990
- Coeficiente de Correlación r ≥ 0.995 C: 0.9996 C: 0.9991 C: 0.9989
(r)
A: 0.9995 A: 0.9987 A: 0.9979
- Coeficiente de r2 ≥ 0.990 C: 0.9992 C: 0.9981 C: 0.9978
Determinación (r2)
- Test estadístico T Student A: A: A:Texp>Ttablas Texp=155.554 Texp=98.858 Texp=79.395
de verificación de la
Ttablas=2.160 Ttablas=2.160 Ttablas=2.160
pendiente “b” o de C: C: C:
Linealidad Texp=124.760 Texp=83.314 Texp=77.287
Ttablas=2.160 Ttablas=2.160 Ttablas=2.160
- Test estadístico T Student Texp<Ttablas A: A: A:
de verificación de la Texp=0.817 Texp=0.612 Texp=0.277
variable Ttablas=2.160 Ttablas=2.160 Ttablas=2.160
independiente(intercepto) C: C: C:
Texp=0.069 Texp=0.464 Texp=0.264
o de la proporcionalidad “a”
Ttablas=2.160 Ttablas=2.160 Ttablas=2.160
67
- Test estadístico T Student Tr >Ttablas A: A: A:
del Coeficiente de Tr= 155.554 Tr= 98.858 Tr= 79.395
Correlación (r) Ttablas=2.160 Ttablas=2.160 Ttablas=2.160
C: C: C:
Tr= 124.760 Tr =83.314 Tr=77.287
Ttablas=2.160 Ttablas=2.160 Ttablas=2.160
- Test Distribución normal Valor p ≥ 0.05
de los residuales A: A: A:
Valor p =0.109 Valor p =0.838 Valor p=0.760
C: C: C:
Valor p = 0.79 Valor p=0.802 Valor p = 0.95
A: Ambroxol C: Clenbuterol
Tabla 23: Resultados de la Linealidad del sistema para Ambroxol - Serie 1
68
LINEALIDAD DE SISTEMA
150.000
140.000
130.000
120.000
110.000 y = 384.1040 x + 2.3593
R² = 0.9995
100.000
90.000
0.200 0.220 0.240 0.260 0.280 0.300 0.320 0.340 0.360 0.380
Concentraciones(mg/mL)
Figura 1: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 1 - Ambroxol
Tabla 24: Resultados de la Linealidad del sistema para Ambroxol - Serie 2
69
LINEALIDAD DE SISTEMA
150.000
140.000
130.000
120.000
y = 382.7548 x + 2.7720
110.000 R² = 0.9987
100.000
90.000
0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400
Concentraciones(mg/mL)
Figura 2: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 2 - Ambroxol
Tabla 25: Resultados de la Linealidad del sistema para Ambroxol - Serie 3
70
LINEALIDAD DE SISTEMA
150.000
140.000
130.000
120.000
y = 387.0380 x + 1.5807
110.000 R² = 0.9979
100.000
90.000
0.120 0.180 0.240 0.300 0.360 0.420 0.480
Concentraciones(mg/mL)
Figura 3: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 3 – Ambroxol
Tabla 26: Resultados de la linealidad del sistema para Clenbuterol - Serie 1
71
LINEALIDAD DE SISTEMA
3.000
2.500
y = 11,690.6024 x + 0.0051
2.000
R² = 0.9992
1.500
0.000 0.000 0.000
Concentraciones(mg/mL)
Figura 4: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 1 – Clenbuterol
Tabla 27: Resultados de la linealidad del sistema para Clenbuterol - Serie 2
72
LINEALIDAD DE SISTEMA
5.000
4.500
4.000 y = 11,626.1834 x + 0.0507
3.500 R² = 0.9981
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
0.000 0.000 0.000
Concentraciones(mg/mL)
Figura 5: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 2 - Clenbuterol
Tabla 28: Resultados de la linealidad del sistema para Clenbuterol - Serie 3
73
LINEALIDAD DE SISTEMA
3.500
3.000
2.500
2.000 y = 11,700.2889 x + 0.0313
R² = 0.9978
1.500
1.000
0.000 0.000 0.000 0.000
Concentraciones(mg/mL)
Figura 6: Gráfica de la Linealidad del sistema serie 3 – Clenbuterol
3.3.2 Linealidad del método
Tabla 29: Evaluación de los resultados de la Linealidad del método
Parámetro Límites Resultados
Linealidad del método
-  Ecuación de la recta y= bx + a A: y=385.9121X + (1.0461)
C: y=12516.15X + (-0.0907)
-  Coeficiente de Correlación (r) r > 0.995 A:0.9996
C:0.9972
-  Coeficiente de Determinación (r2) r2 > 0.990 A: 0.9992
C: 0.9945
-  Test estadístico T Student de Texp > Ttablas A: Texp=187.214 Ttablas= 2.048
verificación de la pendiente “b” o C: Texp=70.912    Ttablas= 2.048
de la Linealidad
74
-  Test estadístico T Student de Texp < Ttablas A: Texp=0.307     Ttablas= 2.048
verificación de la variable C: Texp=0.464     Ttablas= 2.048
independiente (Intercepto) o de
proporcionalidad “a”
-  Test estadístico T Student del Tr > Ttablas A: Tr= 187.214    Ttablas= 2.048
coeficiente de correlación (r) C: Tr= 70.912      Ttablas= 2.048
-  Test Distribución normal de los Valor p ≥ 0.05 A: Valor p = 0.466
residuales. C: Valor p = 0.55
A: Ambroxol C: Clenbuterol
Tabla 30: Resultados de la linealidad del método de Ambroxol.
75
Figura 7: Gráfica de la Linealidad del método – Ambroxol
Tabla 31: Resultados de la linealidad del método de Clenbuterol
76
LINEALIDAD DE MÉTODO
4.000
3.000
2.000
y = 12,516.1475 x - 0.0907
R² = 0.9945
1.000
0.000 0.000 0.000 0.000
Concentraciones(mg/mL)
Figura 8: Gráfica de la Linealidad del método – Clenbuterol
3.4 Exactitud del método
Tabla 32: Evaluación de los Resultados de la Exactitud del Método
Parámetro Límites Resultados
Exactitud del
método: A: 100.1%
- Porcentaje de 98% - 102% C: 100.5%
recuperación (%R)
- Coeficiente de CV ≤ 2.0% A: 0.4%
variación (CV) C: 1.4%
- Test de Hipótesis Texp < Ttablas A: Texp=1.738    Ttablas= 2.056
C: Texp=1.945     Ttablas=2.056
 A: Ambroxol C: Clenbuterol
77
Tabla 33: Resultados de la exactitud del método para Ambroxol.
78
Tabla 34: Resultados de la exactitud del método para Clenbuterol
79
3.5  Precisión del método
Tabla 35: Evaluación de los resultados de la Precisión del Método
Parámetro Límites Resultados
Precisión del método:
- Repetibilidad CV ≤ 2.0% A:         0.16%
Valor p ≥0.05            p= 0.102
C:          0.41%
            p= 0.159
- Precisión intermedia entre CV ≤ 2.0% A: Entre analista: 0.23%
analistas y equipos      Entre equipos: 0.48%
C: Entre analista: 1.00%
     Entre equipos: 1.08%
- Prueba de Normalidad (P.I. Valor p ≥ 0.05 A: Entre analista:
diferente analista) Analista 1: Valor p = 0.930
Analista 2: Valor p = 0.243
C: Entre analista:
Analista 1: Valor p = 0.384
Analista 2: Valor p = 0.828
- Prueba de varianza iguales Valor p ≥ 0.05 A: Valor p = 0.352
(P.I. diferentes analistas) C: Valor p = 0.047
- Prueba de medias (T de 2 Valor p ≥ 0.05 Las medias A: Valor p = 0.727
muestras) (P.I. diferentes son iguales, Si valor p < 0.05 C: Valor p = 0.671
analistas) las medias son diferentes En ambos las medias son
iguales.
- Prueba de normalidad de  Valor p ≥ 0.05 A: Entre equipos:
grupos (P.I. diferentes ASCL-001: Valor p= 0.158
equipos) CCCL-007: Valor p= 0.057
80
CCCL-005: Valor p= 0.930
C: Entre equipos:
ASCL-001: Valor p= 0.384
CCCL-007: Valor p= 0.227
CCCL-005: Valor p= 0.486
- Prueba de varianzas (P.I. Valor p ≥ 0.05 varianzas A: Entre equipos:
Diferentes equipos) iguales      Valor p=0.006
Valor p < 0.05 varianzas C: Entre equipos:
diferentes.      Valor p= 0.098
- Prueba de medias Valor p ≥ 0.05 las medias A: Entre equipos:
(ANOVA) (P.I. diferentes son iguales, si valor de p <      Valor p=0.905
equipos) 0.05 las medias son C: Entre equipos:
diferentes.      Valor p= 0.854
Las medias son iguales.
A: Ambroxol C: Clenbuterol
Tabla 36: Resultados de Precisión: Repetibilidad en Ambroxol
81
Tabla 37: Resultados de Precisión: Repetibilidad en Clenbuterol
Tabla 38: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes analistas para
Ambroxol.
82
Tabla 39: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes equipos para
Ambroxol.
Tabla 40: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes analistas para
clenbuterol.
83
Tabla N°41: Resultados de Precisión Intermedia: Diferentes equipos para
Clenbuterol.
3.6 Límite de Detección y límite de cuantificación
Tabla 42:
Evaluación de los resultados de Límite de Detección y Cuantificación
Parámetro Límites Resultados
Límite de Detección y
Cuantificación
- Coeficiente de correlación r ≥ 0.995             A: 0.9999
C: 0.9999
- Coeficiente de r2 ≥ 0.990 A: 0.9998
Determinación. C: 0.9999
- Límite de detección Concentración mínima A: 1.9052ppm o
aceptable del analito 0.0019052mg/mL.
que es detectable. C: 0.001949ppm o
0.0000019mg/mL.
84
- Límite de cuantificación Concentración mínima A: 2.3003ppm o
aceptable de un analito 0.0023003mg/mL
que es cuantificable. C: 0.004971ppm o
0.0000050mg/mL.
A: Ambroxol C: Clenbuterol
Tabla 43: Resultados de Límite de cuantificación y detección para ambroxol.
Figura 9: Gráfica del Límite de detección y cuantificación para ambroxol
85
Tabla 44: Resultados de Límite de cuantificación y detección para clenbuterol.
Figura 10: Gráfica del Límite de detección y cuantificación para clenbuterol.
86
3.7 Robustez
Tabla 45: Evaluación de los resultados de Robustez
Parámetro Límites Resultados
Robustez:
- Condiciones normales Alteración de resultado A: Producto terminado: 0.0%
≤ 2.0% C: Producto terminado: 0.0%
- Variaciones
cromatográficas:
· T 35ºC en la Alteración de resultado A: Producto terminado: 0.4%
columna. ≤ 2.0% C: Producto terminado: 0.4%
- Variación en las
condiciones de
almacenamiento de la
solución estándar y
muestra:
· Condición 24 horas Alteración de resultado A: Producto terminado: 1.8%
de reposo. ≤ 2% C: Producto terminado: 1.1%
· Condición 24 horas Alteración de resultado A: Producto terminado: 0.7%
en refrigeración. ≤ 2% C: Producto terminado: 0.5%
· Condición 48 horas Alteración de resultado A: Producto terminado: 0.5%
en refrigeración. ≤ 2% C: Producto terminado: 0.7%
A: Ambroxol C: Clenbuterol
87
Tabla 46: Resultados de Robustez en Ambroxol
88
Tabla 47: Resultados de Robustez en Clenbuterol
3.8 Rango
Tabla 48: Evaluación de los resultados de Rango.
Parámetro Límites Resultados
Rango 80% - 120% A:80% - 120%
C:80% - 120%
89
IV. DISCUSIÓN
4.1 . DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Ø La técnica analítica para la identificación y cuantificación por HPLC de
ambroxol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol 0,005mg/5mL en jarabe, dada que
no figura en ningún libro oficial, debe ser validada con antelación al manejo
habitual. Por ello, al realizar el desarrollo de la validación con los ensayos,
procedimientos y evaluación de los resultados obtenidos, nos ha permitido
poder corroborar el alto grado de confiabilidad, eficacia, calidad y seguridad
que la técnica presenta.9
Ø La adecuación del sistema conocido también como aptitud del
sistema, posibilita que antes de poner en marcha cualquier actividad
cromatográfica, nos asegure que el equipo se encuentra en óptimas
condiciones para ser usado8. La aptitud del sistema consistió en evaluar
áreas, tiempo de retención, asimetría y platos teóricos de dos estándares
tanto para ambroxol como para clenbuterol, donde se determinó el promedio,
el coeficiente de variación, desviación estándar y los resultados cumplieron
con los límites establecidos como se puede apreciar en las tablas
14,15,16,17.
Ø Al evaluar el parámetro de Especificidad se obtuvo resultados por
Identificación y por degradación. La técnica analítica resultó ser específica,
puesto que los analitos y producto terminado no evidenciaron interferencia
con probables componentes que pudieran alterar, y nos permitió su
identificación, cumpliendo con los criterios de aceptación del porcentaje (%)
interferencia ≤2%. La especificidad por identificación empleó soluciones de
la fase móvil, los componentes de la fórmula (estándar mixto, analito puro,
otros), las soluciones de trabajo (estándar mixto, producto terminado), y el
placebo como se puede observar en la tabla 18 y anexo A5 (figuras
13,14,15,16,17,18). Los resultados presentan ausencia de interferencia
tanto para Ambroxol como para Clenbuterol con las soluciones utilizadas en
la fase móvil. En los componentes de la fórmula, la corrida no evidenció
interferencia, pero se identificaron los picos de Ambroxol a los 47.4 min de
retención y para clenbuterol de 22.9 min en el estándar mixto y los analitos.
90
En la corrida con las soluciones de trabajo, en el estándar mixto se
identificaron picos de Ambroxol a los 47.7 min de retención y con clenbuterol
a los 23.1 min. Asimismo, en la corrida con el producto terminado no
presentó interferencia y los picos de identificación para ambroxol fue en un
tiempo de retención de 47.7 min y para clenbuterol a los 23.0 min. Con el
placebo no mostró evidencia interferencia.
En la especificidad por degradación, al ser sometidos los analitos, placebo y
producto terminado a condición normal, degradación por hidrolisis acida,
básica, oxidativa, por termólisis, por fotólisis; evaluamos los resultados como
indica la tabla 19, y mostró que el ambroxol frente a una hidrólisis oxidativa,
la solución del analito se ve afectado, presentando una interferencia mayor
del 2.0% en su degradación (ver tabla 20). Asimismo, clenbuterol al ser
sometido a estas condiciones antes descritas, no detectaron picos que
interfieran con el pico principal en sus cromatogramas correspondientes, sin
embargo, en la degradación por termólisis y fotólisis con luz UV, hidrólisis
ácida, básica, oxidativa, afectaron la solución del analito y presentó una
interferencia mayor al 2.0% en su degradación (ver tabla 21). La solución del
producto terminado se vio también afectado frente a las condiciones de
degradación por hidrólisis ácida, básica, y por fotólisis con luz natural a una
exposición de 24 horas, donde la interferencia fue mayor en un 2.0% en su
degradación (ver tabla 21). Para Acosta Neira y Nina Flores también
presentaron las mismas observaciones, entonces se puede pensar que
someter las muestras o producto terminado a estas condiciones podrían
advertir que el producto se degrade y pierda su acción.9
Ø La USP vigente, la ICH y guías de calidad de las autoridades
reguladoras en los países de alta vigilancia sanitaria, establece que la
linealidad debe ser evaluada por la linealidad del sistema y linealidad del
método, donde nuestros resultados mostraron que el método analítico es
lineal. En la linealidad del sistema, los resultados tratados fueron
directamente proporcionales a la concentración del analito, dentro de un
rango conocido (80% a 120%),donde se trabajó con tres series, analizadas
por triplicado y con un sistema de estándares al
80%,90%,100%,110%,120%.3,6. Como resultado de las lecturas del
91
coeficiente de correlación(r) para ambroxol en las tres series(1,2,3) fue de
0.9997; 0.9993 y 0.9990 respectivamente y para clenbuterol en las tres
series (1,2,3) fue de  0.9996; 0.9991 y 0.9989 respectivamente. Asimismo,
en la linealidad del método el coeficiente de correlación (r) para ambroxol fue
0.9996 y para clenbuterol 0. 9972.Siendo el límite aceptable de r≥ 0.995.
Ø Según la farmacopea vigente (USP), registros de la ICH, denotan que
el parámetro de exactitud debe calcularse obteniendo el porcentaje de
recuperación entre el analito hallado y el analito añadido. Siendo nuestro
porcentaje de recuperación para ambroxol clorhidrato 100.1% y para
clenbuterol 100.5%, en un límite de 98%a 102%. Sin embargo, para Acosta
Neira y Nina Flores, el porcentaje de recuperación fue de 99.87% para
ambroxol clorhidrato y 99.87% para clenbuterol clorhidrato en un rango de
97% a 103%. Estos resultados comparados con nuestro estudio son
similares dentro del rango permitido.9. Asimismo, para Tapia, a pesar de
trabajar en su análisis con solución oral gotas, el porcentaje de recuperación
en ambroxol clorhidrato fue de 100.17%, dicho valor se encontró dentro del
rango aceptable.19
Ø El parámetro de precisión según los libros oficiales y criterios técnicos
de evaluación de un dossier de especialidades farmacéuticas, Directiva
sanitaria Nº 001 MINSA/DIGEMID, debe ser evaluado en repetibilidad, y
precisión intermedia (con diferentes analistas, diferentes equipos, diferentes
días, etc.). La repetibilidad se dio en funcionamiento sucesivos en un solo
día y bajo las mismas condiciones de medición, siendo repetible nuestra
técnica analítica, la cual tuvo un coeficiente variación (CV) para ambroxol de
0.16%, y para clenbuterol 0.41%, cumpliendo los límites de aceptación de
CV ≤ 2%. La repetibilidad del método para el estudio Guillen Gonzales en
sus resultados, mostraron un CV de 0.47% para ambroxol y 1,68% para
clenbuterol. Ambos estudios a pesar que no tienen los mismos resultados,
cumplen con los criterios aceptables8. La precisión intermedia se realizó
tanto entre diferentes analistas como diferentes equipos, donde el CV para
ambroxol fue de 0.23% y 0.48% respectivamente, y el CV para clenbuterol
fue de 1.00% y 1.08% respectivamente. Como resultado de esta evaluación
se evidencia que la técnica analítica es precisa en las condiciones
propuestas.
92
Ø El límite de detección que es la concentración mínima aceptable del
analito que se puede detectar, para ambroxol fue de 1.9052ppm y para
clenbuterol 0.001949ppm. El límite de cuantificación, que es la
concentración mínima aceptable del analito que se puede cuantificar, para
ambroxol fue de 2.3003ppm y para clenbuterol 0.004971ppm. Asimismo, se
evalúa el coeficiente de correlación (r) y el coeficiente de determinación.
Donde el límite de aceptación para el coeficiente de correlación es r ≥0.995,
y como resultado para ambroxol y clenbuterol se obtuvo 0.9999. El límite de
aceptación del coeficiente de determinación r2 ≥0.990, lo cual para ambroxol
mostró un resultado de 0.9998 y para clenbuterol 0. 9999.Sin embargo, para
la USP y la ICH este parámetro, su evaluación no es exigida.3,6,8
Ø Siendo la robustez un parámetro que puede ser incluido o no en la
validación de un procedimiento analítico, este nos indica resultados
aceptables, precisos y exactos al someterlos a una variedad de
condiciones6,7 .El método resultó ser robusto frente a condiciones normales
y a modificaciones cromatográficas (Temperatura 35ºC de la columna
cromatográfica Zorbax XDB-C18) tanto para ambroxol como para
clenbuterol, presentando una alteración del resultado ≤ 2% como límite
permitido como se observa en la tabla 45; Frente a la exposición de
diferentes condiciones de almacenamiento (reposo por 24 horas a
temperatura ambiente que se consideró hasta los 30ºC y refrigeración por
24 y 48 horas que osciló entre 2ºC - 8ºC), los activos en estudio estuvieron
dentro del límite establecido.
Ø En la tabla 48, se puede apreciar que, mediante ensayos analíticos ya
antes evaluados como son exactitud, precisión y linealidad, el rango de
nuestra técnica analítica es de 80% al 120%. Rango comprendido entre las
concentraciones máximas y mínimas del analito estudiado.
93
4.2 . CONCLUSIONES
En base a los resultados obtenidos podemos concluir que:
1. Se validó la técnica analítica de referencia para la identificación y
cuantificación por HPLC de ambroxol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe, cumpliendo con todos los
parámetros exigidos.
2. Del mismo modo, se determinaron los parámetros de validación de
la técnica analítica para la identificación y cuantificación por
cromatografía líquida de alta resolución de ambroxol clorhidrato
7,5mg + clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe, y estos
luego de aplicarse los procedimientos correspondientes, mostraron
como resultado que:
-  En la Especificidad, la técnica analítica es especifica,
identificándose no haber interferencia con el pico del analito
estudiado. El tiempo de retención de Ambroxol clorhidrato fue de
47.7 min y Clenbuterol clorhidrato 23.0 min. Asimismo, las
soluciones de placebo, analito y producto terminado tanto de
Ambroxol como Clenbuterol sometidas a degradación por condición
normal, hidrólisis acida, básicas, oxidativas, termólisis, fotólisis por
luz natural y UV, no detectaron picos de interferencias con el pico
principal en sus cromatogramas correspondientes.
- En la Linealidad, la técnica demuestra que el parámetro es lineal, y
los datos evidencian distribución normal, la cual estuvo comprendida
en un rango del 80% - 120%, donde en la linealidad del sistema, el
coeficiente correlación (r) para ambroxol clorhidrato en las tres series
(1,2,3) fueron de 0.9997; 0.9993 y 0.9990 respectivamente y para
clenbuterol en las tres series (1,2,3) se obtuvieron 0.9996; 0.9991 y
0.9978 respectivamente. En la linealidad del método, el coeficiente
de correlación (r) fue de 0.9996 para ambroxol y 0.9972 para
clenbuterol, siendo el criterio de aceptación r≥0.995.
- En la Precisión, se concluye que, para este parámetro la prueba de
repetibilidad tuvo un coeficiente de variación para ambroxol de
0.16% y para clenbuterol 0.41%; la precisión intermedia de
94
diferentes analistas y diferentes equipos para ambroxol fue de 0.23%
y 0.48% respectivamente. Asimismo, la precisión intermedia de
diferentes analistas y diferentes equipos para clenbuterol fue de
1.00% y 1.08% respectivamente.
- En la Exactitud, la técnica es exacta con un porcentaje de
recuperación de 100.1% para ambroxol clorhidrato y 100.5% para
clenbuterol clorhidrato.
- En el Límite de Detección y Cuantificación, se llegó a concluir que,
para el límite de detección la concentración encontrada en ambroxol
fue de 1.9052ppm y en clenbuterol 0.001949ppm; del mismo modo,
el límite de cuantificación encontrado en ambroxol fue de 2.3003ppm
y en clenbuterol 0.004971ppm.
- En la Robustez, se concluye que, la técnica analítica demostró ser
robusta, evidenciándose que las soluciones de los analitos y
producto terminado sometidas a condiciones normales, a
modificación del sistema cromatográfico (temperatura de la
columna), a variaciones en las condiciones de almacenamiento de
las soluciones estándar y muestra, los resultados cumplieron con
criterios de aceptación.
- En el Rango, concluimos que luego de aplicarse el procedimiento
analítico y cumpliendo satisfactoriamente los parámetros de
exactitud, precisión y linealidad, este intervalo oscila dentro de los
límites de aceptación.
3. En cuanto a la técnica analítica propuesta se concretó que ella es
confiable, reproducible y aplicable en los equipos y productos de
laboratorios S. J. Roxfarma S.A, pudiéndose utilizar en los análisis
de rutina.
4. Los resultados de las pruebas obtenidas cumplieron con los criterios
de aceptación, por lo que se documentó la validación de la técnica
analítica propuesta.
95
4.3 . RECOMENDACIONES
ü Se recomienda implementar como parte de un procedimiento
habitual en los laboratorios, la validación de las técnicas o
procedimientos analíticos de los principios activos que se
comercializan, ello permitirá que sus productos farmacéuticos
mantengan la confiabilidad y sean reproducibles.
ü En la aplicación y desarrollo del procedimiento analítico se debe
seguir tal cual indica la técnica y protocolo analítico. Entre los
cuales se debe tener en cuenta: Acondicionar el sistema
cromatográfico durante una hora antes de iniciar el análisis, en la
preparación de la fase móvil se recomienda mezclar y gasificar
durante diez minutos.
ü El analista que empieza a desarrollar la validación de la técnica
debe concluirlo hasta el final, esto evitará errores y confusiones
en los resultados que se puedan obtener.
ü Se recomienda no someter los principios activos estudiados a
condiciones que afecten su degradación.
ü Se recomienda que cualquier cambio en la metodología de la
técnica validada, esta debe ser revalidada.
ü Cualquier cambio en la fórmula con respecto a los proveedores se
debe realizar un estudio (análisis de riesgo) para ver el impacto
que repercute sobre en el producto final.
ü Se recomienda a los futuros profesionales realizar estudios de
investigación sobre validaciones de métodos o técnicas analíticas
en la industria farmacéutica, con el propósito de aprender, de
estar calificado, ser competente y aptos en la realización de
dichos procesos, mejorando así las operaciones del control de
calidad.
96
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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https://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/20.500.12672/1606
100
ANEXOS
ANEXO A: INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS.
Anexo A1: Parámetros de desempeño analítico que debe una validación de
técnicas analíticas propias.
Categoría II
Pruebas
Parámetros de Categoría Análisis de Categoría Categoría
Desempeño Analítico I Cuantitativo Límite III IV
Exactitud SI SI * ** NO
Repetibilidad SI SI NO SI NO
Precisión
Precisión intermedia SI# SI# NO SI# NO
Especificidad SI SI SI ** SI
Límite de Detección NO NO SI * NO
Límite de
Cuantificación NO SI NO * NO
Linealidad SI SI NO ** NO
Intervalo/Rango SI SI * * NO
* Puede requerirse, dependiendo de la naturaleza del método.
** Puede ser no necesaria en algunos casos
# En casos donde la reproducibilidad ha sido realizada, la precisión
intermedia no es necesaria.
101
Anexo A2: Hoja de trabajo utilizada en la validación de los parámetros.
ÁREA DE CONTROL DE CALIDAD
HOJA DE TRABAJO
Producto :
Presentación :
Lote : Solicitud de Análisis N° :
Técnica Analítica (TA) : Fecha Inicio de Análisis :
Especificación Básica (EB) : Fecha Final de Análisis :
Validación de Métodos Analíticos - Valoración APTITUD DE SISTEMA
Datos del estándar:
Principio activo : Factor Estándar (Fst) :
Estándar tipo :
Nº Análisis : Formula =
Potencia (t/c) :
F. Reanálisis : Fst1 =
F. Vencimiento : Fst2 =
Peso Estándar  (Wst 1 ):
Peso Estándar  (Wst 2 ):
Principio activo : Factor Estándar (Fst) :
Estándar tipo :
Nº Análisis : Formula =
Potencia (t/c) :
F. Reanálisis : Fst1 =
F. Vencimiento : Fst2 =
Peso Estándar  (Wst 1 ):
Peso Estándar  (Wst 2 ):
Principio activo : Factor Estándar (Fst) :
Estándar tipo :
Nº Análisis : Formula =
Potencia (t/c) :
F. Reanálisis : Fst1 =
F. Vencimiento : Fst2 =
Peso Estándar  (Wst 1 ):
Peso Estándar  (Wst 2 ):
Observaciones :
Conclusión: El producto analizado es CONFORME ó NO CONFORME con las
especificaciones y métodos analíticos establecidos.
Nombre y Firma Nombre y Firma
ANALISTA RESPONSABLE FQ
102
Anexo A3: Certificados de calificación y verificación de instalación
operacional del equipos e instrumentos.
103
104
105
Anexo A4:  Cromatogramas - Aptitud del Sistema
106
Anexo A4: Cromatogramas – Aptitud del Sistema
Figura 11: Cromatograma de Ambroxol + Clenbuterol en aptitud del sistema
del estándar 1.
Figura 12: Cromatograma de Ambroxol + Clenbuterol en aptitud del sistema
del Estándar 2
107
Anexo A5: Cromatogramas – Especificidad por identificación
Figura 13: Especificidad por identificación de la fase móvil
108
Figura 14: Especificidad por identificación del analito Ambroxol
109
Figura 15: Especificidad por identificación del analito Clenbuterol
110
Figura 16: Especificidad por identificación del Estándar mixto
111
Figura 17: Especificidad por identificación del producto terminado
112
Figura 18: Especificidad por identificación del Placebo
113
ANEXO B:  MATRIZ DE CONSISTENCIA
Título: VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN DE AMBROXOL CLORHIDRATO 7,5mg + CLENBUTEROL
CLORHIDRATO 0,005mg/5mL EN JARABE.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA OBJETIVOS HIPÓTESIS
Problema General Objetivo General Hipótesis General
¿La técnica analítica para la Validar la técnica analítica para La validación de la técnica analítica
identificación y cuantificación por identificación y cuantificación por para la identificación y cuantificación
cromatografía líquida de alta cromatografía líquida de alta por cromatografía líquida de alta
resolución de ambroxol clorhidrato resolución de   ambroxol clorhidrato resolución de ambroxol clorhidrato
7,5mg + clenbuterol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clorhidrato
0,005mg/5mL jarabe que se propone 0,005mg/5mL en jarabe. 0,005mg/5ml en jarabe cumplen con los
cumplirá con las especificaciones parámetros establecidos.
establecidas para la validación?
Problemas Específicos Objetivos Específicos Hipótesis Específicas
¿Se logrará desarrollar los Determinar los parámetros de El proceso validación de la técnica
parámetros de validación de la validación de la técnica analítica para analítica para identificación y
técnica analítica por cromatografía identificación y cuantificación por cuantificación por cromatografía líquida
líquida de alta resolución de ambroxol cromatografía líquida de alta de alta resolución de ambroxol
clorhidrato 7,5mg + clenbuterol resolución de ambroxol clorhidrato clorhidrato 7,5mg + clenbuterol
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe 7,5mg + clenbuterol clorhidrato clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe,
según establece la USP vigente con 0,005mg/5mL en jarabe. cumplen con las exigencias en todos los
referencia a exactitud, precisión, parámetros de validación: Exactitud,
especificidad, límite de detección y precisión, especificidad, límite de
cuantificación, linealidad, robustez y detección y cuantificación, linealidad,
rango? robustez y rango.
¿Se podrá comprobar que la técnica Comprobar si la técnica analítica de La técnica analítica para la
analítica para la identificación y referencia para la identificación y identificación y cuantificación por
cuantificación por cromatografía cuantificación por cromatografía cromatografía líquida de alta resolución
líquida de alta resolución de ambroxol líquida de alta resolución de ambroxol de ambroxol clorhidrato 7,5mg +
clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe, clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe, jarabe, es aplicable en los equipos y
es aplicable en los equipos y es aplicable en los equipos y productos de laboratorio farmacéuticos
productos de laboratorios productos de laboratorios S.J. Roxfarma.
farmacéuticos S.J. Roxfarma? farmacéuticos S.J. Roxfarma.
¿Serán confiables los resultados de Documentar que los resultados de las Los resultados de las pruebas
la validación de la técnica analítica pruebas obtenidas en la técnica obtenidas en la técnica analítica son
para la identificación y cuantificación analítica son confiables y cumplen confiables y cumplen con los criterios de
por cromatografía líquida de alta con los criterios de aceptación para la aceptación para la validación por
resolución de ambroxol clorhidrato validación por cromatografía líquida cromatografía líquida de alta resolución
7,5mg + clenbuterol clorhidrato de alta resolución de ambroxol de ambroxol clorhidrato 7,5mg +
0,005mg/5mL en jarabe? clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en
clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe. jarabe.
Metodología:
ENFOQUE:  Cuantitativo, prospectivo y longitudinal.
DISEÑO:       Experimental
POBLACION:  Lote industrial de 1200L de ambroxol clorhidrato 7,5mg + clenbuterol clorhidrato 0,005mg/5mL en jarabe
comercializados por laboratorios S.J. Roxfarma.
MUESTRA:     10 frascos de 120mL de ambroxol + clenbuterol jarabe, que es el 0.1% de la población.
TECNICA: - HPLC.
INSTRUMENTO: Hojas de trabajo o ficha de registro, Excel, Formato minitab 18.
114
ANEXO C: OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
Operacionalización de variable independiente
VARIABLE DEFINICION DEFINICION DIMENSIONES INDICADOR VALOR
CONCEPTUAL OPERACIONAL FINAL DE
1 DE LA DE LA LA
VARIABLE VARIABLE VARIABLE
Identificación y La identificación y La identificación y Técnica Criterios de ü Cumple
cuantificación de cuantificación de cuantificación de analítica aceptación
ambroxol un principio ambroxol + según USP
clorhidrato 7,5mg + activo son clenbuterol en vigente. ü No
y clenbuterol procedimientos jarabe se realiza cumple
clorhidrato que requieren de aplicando la
0,005mg/mL en análisis técnica analítica
jarabe. necesarios para mediante el uso
obtención del HPLC, que
resultado optimo, nos permite tener
haciendo uso de resultados
la cromatografía exactos y fiables.
líquida de alta
resolución
(HPLC).
115
Operacionalización de variable dependiente
VARIABLE 2 DEFINICIÓN DEFINICIÓN DIMENSIONES INDICADOR VALOR
CONCEPTUAL DE OPERACIONAL FINAL DE
LA VARIABLE DE LA LA VA
VARIABLE RIABLE
Validación de Validación de La validación de Parámetros de Criterios de ü Conforme
la técnica Métodos analíticos la técnica desempeño: aceptación
analítica por es el proceso por el analítica por según USP
HPLC cual queda HPLC es un -  Aptitud del vigente.
establecido por procedimiento sistema:
estudios documentado ü No
experimentales y/o mediante conforme
de laboratorio, que pruebas en el - Especificidad:
la capacidad del laboratorio, § E. Por
método y basado identificación.
características de confirmación de § E. Por
desempeño cumple los resultados degradación.
con los requisitos que se esperan
para la aplicación cumpliendo con
analítica deseada.1 los criterios de
aceptación de - Linealidad:
Los parámetros los parámetros § L.del sistema
requeridos para la de desempeño.16 § L. del método
validación son:
ü Exactitud - Exactitud
ü Precisión
ü Linealidad - Precisión:
ü Especificidad § Repetibilidad.
ü Límite de § P. Intermedia
cuantificación diferente
ü Límite de analista
detección. § P. Intermedia
ü Robustez diferente
ü Rango equipo.
- Límite de
identificación y
cuantificación
- Rango
116
ANEXO D: Carta de aprobación para la ejecución del proyecto de tesis.
117
ANEXO E: Fotografías del trabajo de campo
Figura 19: Tesistas preparando las soluciones de trabajo para el
desarrollo de la validación de la técnica analítica.
118
Figura 20: Tesista analizando las muestras antes de introducir al cromatógrafo
líquido de alta resolución.
Figura 21: Tesistas evaluando los resultados generados por el cromatógrafo.
119