FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LAS HOJAS DE Solanum aphyodendron S. KNAPP (Olmish) SOBRE BACTERIAS GRAMNEGATIVAS TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO AUTORES: Bach. NAVARRO GONZALES, ROY ADONIS https://orcid.org/0000-0002-9988-1279 Bach. BALTAZAR SALVADOR, KAREN NOELIA https://orcid.org/0000-0002-8768-9335 ASESOR: Dr. VILCHEZ CÁCEDA, HÉCTOR ALEXANDER https://orcid.org/0000-0001-7094-0821 LIMA – PERÚ 2022 i DEDICATORIA Quiero agradecer a Dios por guiar e iluminar mi camino, a mis padres Silvia y Heber por brindarme su amor, cariño y todo su esfuerzo para que esto sea posible, a mis hermanos por estar siempre en los buenos y malos momentos, y a todas las personas que estuvieron presentes en mi vida. Gracias a todos ustedes, los amo. Roy Adonis Navarro Gonzales A Dios, por guiarme y acompañarme en cada paso que doy. A mis padres, por su apoyo incondicional desde el inicio de mi carrera y no dejaron ni un segundo de creer en mí. A mi hermano, por sus buenos deseos y motivación. Karen Noelia Baltazar Salvador ii AGRADECIMIENTO Queremos agradecer a la Universidad María Auxiliadora por permitirnos seguir con nuestra formación académica; de manera especial al Dr. Héctor Alexander, Vílchez Cáceda por sus consejos, por su conocimiento y por sus recomendaciones acertadas para que se desarrolle este trabajo de investigación. De igual manera agradecer a todos los profesores que nos guiaron en esta etapa académica y por brindarnos sus enseñanzas y sus orientaciones. Roy Adonis Navarro Gonzales Karen Noelia Baltazar Salvador iii Índice General Páginas Resumen viii Abstract ix I. INTRODUCCIÓN 1 II. MATERIALES Y MÉTODOS 6 2.1 Enfoque y diseño de la investigación 6 2.2 Población, muestra y muestreo 6 2.3 Variables de la investigación 7 2.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos 8 2.5 Proceso de recolección de datos 8 2.6 Métodos de análisis estadístico 12 2.7 Aspectos éticos 12 III. RESULTADOS 13 IV. DISCUSIÓN 22 4.1 Discusión de resultados 22 4.2 Conclusiones 26 4.3 Recomendaciones 27 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 28 ANEXOS 35 iv Índice de tablas Tabla 1. Escala de sensibilidad según Duraffourd 11 Tabla 2. Solubilidades del extracto hidroalcohólico desecado de las hojas 13 de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) Tabla 3. Marcha fitoquímica del extracto hidroalcohólico de las hojas de 14 Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) Tabla 4. Efecto antibacteriano in vitro del extracto Hidroalcohólico de las 15 hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) por el método de Kirby Bauer Tabla 5. Estadísticos descriptivos de los resultados del ensayo 16 microbiológico Tabla 6. Comparación de medias por ANOVA 17 Tabla 7. Comparaciones múltiples por la prueba de Tukey 18 Tabla 8. Escala de Duraffourd para el extracto hidroalcohólico de las 20 hojas de olmish Tabla 9. Porcentaje del efecto inhibitorio del extracto hidroalcohólico de 21 las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp v Índice de figuras Figura 1. Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) 3 Figura 2. Selección y limpieza de las hojas de Solanum aphyodendron S. 46 Knapp (olmish) Figura 3. Lavado de las hojas de olmish que están en buen estado 46 Figura 4. Secado de las hojas limpias 47 Figura 5. Molienda de las hojas secas de olmish 47 Figura 6. Preparación del macerado 48 Figura 7. Filtrado del macerado 48 Figura 8. Obtención del extracto seco de las hojas de Solanum 49 aphyodendron S. Knapp (olmish) Figura 9. Ensayo de solubilidad del extracto seco de olmish 49 Figura 10. Ensayo fitoquímico del extracto hidroalcohólico de las hojas 50 de Solanum aphyodendron S. Knapp Figura 11. Preparación del medio de cultivo, Agar Mueller Hinton 50 Figura 12. Preparación del inóculo y el estándar 0,5 McFarland 51 Figura 13. Siembra en las placas de Salmonella enteritidis, Shigella 51 sonnei y Escherichia coli Figura 14. Preparación de los discos del extracto hidroalcohólico de las 52 hojas de olmish a las concentraciones de 25 %, 50 % y 90 % Figura 15. Colocación de los discos sobre las placas sembradas con las 52 bacterias Gramnegativas Figura 16. Incubación de las placas conteniendo el extracto 53 hidroalcohólico de olmish y las cepas bacterianas Figura 17. Lectura de los resultados y medición de los halos de inhibición 53 con un calibrador Vernier vi Índice de Anexos Anexo A. Operacionalización de las variables 36 Anexo B. Instrumentos de recolección de datos 37 Anexo C. Certificado de clasificación taxonómica 40 Anexo D. Certificado de análisis de Salmonella enteritidis ATCC 13076 41 Anexo E. Certificado de análisis de Shigella sonnei ATCC 25931 42 Anexo F. Certificado de análisis de Escherichia coli ATCC 25922 43 Anexo G. Certificado del ensayo microbiológico del extracto 44 hidroalcohólico de las hoja de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) sobre cepas de Salmonella Enteritidis, Shigella sonnei y Escherichia coli. Anexo H. Resolución de proyecto de investigación 45 Anexo I. Evidencias del trabajo de campo 46 vii RESUMEN Objetivo: Evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) sobre bacterias gramnegativas tales como Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 y Escherichia coli ATCC 25922. Métodos: El extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp procedentes del distrito de Apata, provincia de Jauja se obtuvo por maceración en etanol al 70 % durante 14 días; para la detección de metabolitos secundarios se realizó la marcha fitoquímica y el efecto antibacteriano se determinó con el método de Kirby Bauer usando grupos de ensayo a las concentración de 25, 50 y 90 % para el extracto, etanol al 70 % como blanco y ciprofloxacino 5 ug como control positivo frente a Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 y Escherichia coli ATCC 25922. Resultado: En el extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp se detectó la presencia de metabolitos secundarios, observando que los más abundantes fueron compuestos fenólicos, alcaloides, lactonas α, β insaturadas, y en menor abundancia antraquinonas, antocianinas, saponinas y flavonoides. Según el método de Kirby Bauer se determinó que Shigella sonnei ATCC 25931 fue sensible a las concentraciones de 25, 50 y 90 % con un halo de inhibición promedio de 9,50, 10,59 y 12,37 mm respectivamente; comparado con el control positivo que fue sumamente sensible con un halo promedio de 37,03 mm. En las otras cepas no se observó efecto antibacteriano. Conclusiones: El extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) presentó efecto antibacteriano in vitro sobre Shigella sonnei ATCC 25931 a las concentraciones de 25, 50 y 90 %. Palabras clave: Solanum aphyodendron S. Knapp, extracto hidroalcohólico, efecto antibacteriano, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Escherichia coli. viii ABSTRACT Objective: To evaluate the in vitro antibacterial effect of the hydroalcoholic extract of the leaves of Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) on gram- negative bacteria such as Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 and Escherichia coli ATCC 25922. Methods: The hydroalcoholic extract of the leaves of Solanum aphyodendron S. Knapp leaves from the Apata district, Jauja province was obtained by maceration in 70 % ethanol for 14 days, for the detection of secondary metabolites, the phytochemical test was carried out and the antibacterial effect was determined with the Kirby Bauer method. using test groups at the concentrations of 25, 50 and 90 % for the extract, 70% ethanol as a blank and 5 ug ciprofloxacin as a positive control against Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 and Escherichia coli ATCC 25922 Results: In the hydroalcoholic extract of the leaves of Solanum aphyodendron S. Knapp, the presence of secondary metabolites was detected, observing that the most abundant were phenolic compounds, alkaloids, lactones α, β unsaturated, and in less abundance anthraquinones, anthocyanins, saponins and flavonoids. According to the Kirby Bauer method, it was determined that Shigella sonnei ATCC 25931 was sensitive to concentrations of 25, 50 and 90 % with an average inhibition halo of 9,50, 10,59 and 12,37 mm, respectively; compared to the positive control which was highly sensitive with an average halo of 37,03 mm. In the other strains no antibacterial effect was observed. Conclusions: The hydroalcoholic extract from the leaves of Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) presented an in vitro antibacterial effect on Shigella sonnei ATCC 25931 at concentrations of 25, 50 and 90 %. Keywords: Solanum aphyodendron S. Knapp, hydroalcoholic extract, antibacterial effect, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Escherichia coli. ix I. INTRODUCCIÓN Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) son consideradas un problema para la salud pública ya que afectan en su mayoría a los países en vías de desarrollo, especialmente a los lugares que presentan problemas socioeconómicos y deficiencias en los servicios básicos de alcantarillado. Debido a estos factores muchas personas consumen alimentos contaminados con microorganismos, sustancias químicas, etc. Siendo la primera la que causa mayor morbilidad y mortalidad en la población porque es responsable de producir infecciones gastrointestinales, cuyo síntoma característico es la diarrea 1,2. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) las enfermedades del tracto digestivo (enfermedades diarreicas), generadas por el consumo de alimentos contaminados con organismos patógenos como virus, parásitos y bacterias (salmonella no tifoidea, Escherichia coli y Shigella), causan enfermedad en 550 millones de personas y 230 000 de estas mueren anualmente. Además la OMS reporta en el 2017 que esta patología es la segunda en causar mayor mortalidad en niños menores de cinco años, provocando anualmente el fallecimiento de 525 000 niños en el mundo 3,4. Según el boletín epidemiológico del Perú 2021 en la semana 31 se reportaron 349 267 episodios a nivel nacional de enfermedades diarreicas agudas, del cual el 97,8 % fueron diarreas acuosas y el restante diarreas disentéricas, además reporta que el 55, 4 % se presentó en niños mayores de 5 años y el 44,6 % en menores de 5 años, presentando mayor mortalidad en los primeros con un 54,3 % a nivel nacional 5. En el Perú, los casos de infección del tracto digestivo son generados principalmente por bacterias gramnegativas productoras de toxinas tales como Escherichia coli enterohemorrágica, Shigella sonnei y Salmonella enteritidis. Estos microorganismos son transmitidos por alimentos o agua contaminada, presentando un cuadro clínico de gastroenteritis con diarreas acuosas o disentéricas, vómitos y fiebre 6,7. 1 Desde el inicio de la humanidad los habitantes con la finalidad de alimentarse y tratar algunas dolencias, utilizaron de manera empírica los diversos recursos vegetales que encontraban a su alrededor y fue así como descubrían y seleccionaban todas aquellas que tenían cualidades curativas; con el pasar de los años el ser humano empezó a domesticar las plantas y clasificarlas según su necesidad en comestibles y medicinales 8. En la actualidad se utilizan plantas medicinales de manera tradicional para tratar inflamaciones, dolores, infecciones, etc. Por otro lado la ciencia estudia las diversas propiedades que estas presentan, para poder clasificar e identificar los metabolitos que tienen actividad farmacológica 8. En el mundo existen 12 países megadiversos de los cuales 5 están en América del Sur; Perú es uno de ellos ya que cuenta con 25 000 especies vegetales siendo de este grupo 1400 medicinales 8. La familia Solanaceae se encuentra inmersa en esta gran variedad vegetal, contando con aproximadamente 1 500 especies del género Solanum 9. A esta familia se le atribuye una variedad de efectos terapéuticos como analgésica, antiinflamatoria, antioxidante, antibacteriana, sedativas, antimicóticas entre otras; tales propiedades se deben a que esta especie posee metabolitos como solanina, solasodieno, beta solamarina, diosgenina, licopeno y solasodina 10,11,12. Las bacterias como Escherichia coli, Shigella sonnei y Salmonella enteritidis, son bacilos gramnegativos anaerobios facultativos, fermentadores y oxidasa negativos; la transmisión de estas enterobacterias es a través de alimento y/o agua contaminada con heces, la enfermedad más frecuente que generan es gastroenteritis con un cuadro clínico característico de diarreas acuosas o sanguinolentas, fiebre y espasmo abdominal 13,14,15,16. La enfermedad diarreica de origen bacteriano que aqueja a niños, ancianos y personas con inmunodeficiencia, causada por microorganismos de la familia Enterobacteriaceae es considerada un problema de salud pública, además a esto se le suma el uso indiscriminado de antibióticos que con el tiempo generará resistencia en las bacterias 17. 2 La familia Solanaceae viene siendo utilizada desde la antigüedad como alimento y como alternativa para tratar diversas patologías, además en el mundo esta cuenta con aproximadamente 2 200 especies y 95 géneros como Solanum, Lycianthes, Cestrum, Nicotiana, Physales y Lycium, destacando entre ellas la primera con 1 200 especies. Las solanáceas presentan importancia a nivel alimenticio (papa, tomate, ají, etc.), medicinal (belladona y mandrágora) e industrial (tabaco) 18. Sus propiedades farmacoterapéuticas son sedativas, antiinflamatorias, antibacterianas y analgésicas, gracias a sus metabolitos secundarios 10. En el Perú existen 600 especies y 42 géneros de solanáceas entre estas se encuentra Solanum aphyodendron S. Knapp un arbusto o árbol con hojas lanceoladas, con tricomas y con un olor característico; presenta una floración constante de color blanca; el fruto es globoso de color verde que conforme va madurando cambia a un naranja pálido, las encontramos en lugares sombreados y húmedos 18,19,20. Se encuentra distribuido por América del Sur en Bolivia, Colombia, Ecuador, Perú, Venezuela; y por América Central en México, Panamá, El Salvador, Guatemala y Honduras; ubicadas entre 2500 – 3500 m.s.n.m 9. Figura 1. Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) Fuente: Elaboración propia. 3 Entre los antecedentes al desarrollo del trabajo de investigación se dispone de los siguientes: García J, et al (2020), determinaron la actividad antioxidante y antimicrobiana del extracto etanólico de las partes aéreas de Solanum radicans L.F. (huallpachaqui) proveniente de San Juan de Chacña, en la provincia de Aymaraes, departamento de Apurímac. En los resultados se determinó que el extracto etanólico de huallpachaqui al 50 % presentó acción sobre Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, siendo más sensible el primero con un halo de inhibición de 15 mm con respecto al segundo que fue de 12 mm 21. Villalobos C, (2019), comparó el efecto antibacteriano in vitro de los extractos etanólicos de las especies Cinchona officinalis (Cascarilla) y Solanum nigrum (Hierba mora) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923. En el resultado se determinó que Staphylococcus aureus fue sensible al extracto etanólico de Solanum nigrum a 1000 ug/ml con un halo de inhibición media de 19 mm 22. Cachi K, et al (2018), compararon el efecto antibacteriano del aceite esencial y del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum nigrum L. “hierba mora” frente a Pseudomonas aeruginosa. En los resultados se observó que al 100 % el extracto hidroalcohólico de las hojas de hierba mora presentó actividad con un halo de inhibición media de 11,3 mm 23. Ramón-Valderrama J, et al (2020), evaluaron la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos metanólicos de diez especies del género Solanum. En los resultados se determinó que los extractos metanólicos de las hojas Solanum mammosum y Solanum barbeyanum presentaron actividad sobre Escherichia coli con un halo de inhibición de 1 mm a 2 mm 24. Ortiz H, et al (2019), evaluaron la acción antibacteriana de dos extractos uno etanólico y otro metanólicos de S. dolichosepalum sobre una Gram positiva (Staphylococcus aureus) y tres Gram negativas (Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa y Aeromonas hydrophila). En los resultados se determinó que Staphylococcus aureus fue más sensible al extracto etanólico y Pseudomonas aeruginosa al extracto metanólico 25. 4 Cañon T, et al (2018), realizaron el estudio fitoquímico a los extractos etanólicos de las partes aéreas (frutos, hojas y tallos) de la especie vegetal Solanum crinitipes Dunal (Solanaceae) y además evaluaron su actividad antimicrobiana y/o antifúngico y así establecer algún uso potencial de esta especie vegetal. En los resultados se determinó que Staphylococcus aureus fue el más sensible al extracto acetónico de hojas 26. En el Perú existen una gran diversidad de plantas medicinales y muchas son usadas aun de manera empírica, mientras otras cuentan con un sustento científico. Las propiedades terapéuticas atribuidas a estas se deben a que presentan metabolitos bioactivos; es por ello que son usadas en la medicina herbolaria para tratar inflamaciones, infecciones bacterianas o micóticas, dolores, entre otras. Sin embargo en nuestro país y en el mundo las enfermedades transmitidas por los alimentos son consideradas un problema de salud pública que afectan en su mayoría a niños, ancianos y personas inmunodeprimidos; siendo las infecciones gastrointestinales de origen bacteriano la más preocupante 8,1. Por tales consideraciones se decide realizar un estudio a la especie Solanum aphyodendron S. Knapp, la cual será recolectada en la provincia de Jauja. Este estudio se justifica de modo que el recurso vegetal es utilizado hoy en día de manera empírica para tratar alteraciones digestivas (espasmos, cólicos y diarreas); siendo el objetivo demostrar un posible efecto antibacteriano, que de ser cierta permitirá tener una alternativa fitoterapéutica de fácil acceso y económica, además aportará conocimiento para futuras investigaciones. El objetivo general del estudio fue evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) sobre bacterias gramnegativas. La hipótesis general del estudio fue: El extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) presenta efecto antibacteriano in vitro sobre bacterias gramnegativas. 5 II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 ENFOQUE Y DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN Enfoque: Cuantitativo, porque se recolectó información mediante mediciones y análisis estadísticos, para probar la hipótesis planteada 27. Experimental: Porque se manipuló el extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp de manera intencionada para producir un efecto en la variable dependiente 27. Explicativo: Se buscó explicar porque ocurre el fenómeno 27. Correlacional: Permitió conocer la relación que hay entre la variable independiente y la dependiente 27. Prospectivo: Porque los datos se recogieron, midieron y analizaron en el transcurso que sucedieron los hechos (efecto), después de iniciada la investigación 28. Transversal: Porque los datos de la variable independiente fueron medidos en un único momento 28. 2.2 POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO La población vegetal estaba constituida por 6485,7 g de hojas de la especie Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) procedentes del distrito de Apata, provincia de Jauja, departamento de Junín ubicada a una altura de 3340 m.s.n.m. las que fueron recolectadas manualmente en el lugar de cultivo, de este grupo se seleccionaron aquellas que presentaban buen estado, además se retiró las que se encontraban rotas, magulladas, secas y con contaminantes 29. Una vez seleccionadas las hojas se procedió a estabilizarlas en la zona de cultivo de forma natural hasta su traslado al lugar de investigación, allí se procedió a lavar con agua potable, luego se desinfectó y finalmente se enjuago con agua de destilada 29. La muestra estaba constituida por 500 g de hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp trituradas, está se obtuvo de la siguiente manera; obtenidas las hojas limpias se procedió a secarlas en una estufa con aire recirculante a una temperatura de 40 °C y un tiempo de 24 horas. Cumplido este proceso se procedió a triturarlas y almacenarlas en frascos ámbar de vidrio 29. 6 El muestreo fue aleatorizado en la zona de cultivo. La identificación y certificación botánica de las hojas de la especie Solanum aphyodendron S. Knapp se realizó en el consultorio botánico del biólogo José R. Campos de la Cruz. (Ver anexo C) La preparación del extracto se realizó mediante el método de maceración, donde se puso en contacto 500 g de material seco y triturado con 1000 ml de solución hidroalcohólico (etanol 70 % y agua 30 %) el cual fue homogenizada cada cierto periodo por 14 días, cumplido el tiempo se filtró el extracto con papel Whatman N° 1, posteriormente el líquido filtrado se llevó a una estufa a 40 °C para eliminar el disolvente restante y así obtener el extracto seco, finalmente se procedió a almacenarlo en un frasco ámbar de vidrio a temperatura de 2 a 8 °C 29,30. La población bacteriana estuvo constituida por 3 especies de la familia enterobacteriaceae. Para la unidad de análisis se emplearon cepas certificadas de Escherichia Coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076 y Shigella sonnei ATCC 25931 procedentes del laboratorio Miicrobiologics. (Ver anexo D) 2.3 VARIABLES DE INVESTIGACIÓN Variable independiente: Extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish). Definición conceptual: Sustancia obtenida de la mezcla de las hojas de Solanum aphyodendron con una solución de etanol y agua. Definición operacional: El extracto hidroalcohólico es la forma práctica de concentrar y obtener los principios activos que sintetizan los recursos vegetales. Variable dependiente: Efecto antibacteriano in vitro sobre bacterias gramnegativas. Definición conceptual: Conjunto de compuestos que eliminan o reducen el crecimiento bacteriano. Definición operacional: El efecto antibacteriano se determinará mediante el Método Kirby Bauer o método de difusión. 7 2.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS La técnica que se utilizó fue la observación, esta nos permitió recolectar datos de la prueba de solubilidad, de la marcha fitoquímica y mediante el método de Kirby Bauer del ensayo microbiológico, los resultados fueron recogidos en fichas de datos. 2.5 PROCESO DE RECOLECCIÓN DE DATOS 2.5.1 Análisis previo del extracto hidroalcohólico El análisis previo del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) se realizó en el Laboratorio Biológico y Análisis Clínico Santa Rosa E.I.R.L. ubicado en la ciudad de Lima. Obtenido el extracto seco se procedió a realizar los siguientes ensayos. a) Índice afrosimétrico: para este ensayo se pesó 0,5 g de extracto seco de olmish en un tubo de ensayo, a este se agregó 3 ml de agua destilada y se homogenizó, finalmente se observó la presencia de espuma 31. b) Determinación de pH a 25 °C: esta prueba se realizó adicionando 0,5 g de extracto seco a un tubo de ensayo, luego se adiciono 3 ml de etanol 70 % se homogenizo y se midió el pH con un peachímetro 31. c) Prueba de solubilidad: esta prueba se realizó con los siguientes solventes; éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, butanol, etanol 96 %, etanol 70 %, agua destilada y dimetilsulfóxido (DMSO) 30. Para esto se utilizó 8 tubos de ensayos rotulados de manera correlativa y a cada uno de ellos se agregó 0,5 g de extracto y 3 ml de solvente luego se llevó a un agitador vortex por 2 minutos 32. 8 2.5.2 Marcha fitoquímica Este ensayo nos permitió determinar metabolitos secundarios mediante reacciones de coloración y precipitación. Para ello se colocó 0,5 g de extracto hidroalcohólico seco de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp a un tubo de ensayo, luego se procedió a adicionar etanol 70 %, de esta solución se tomó 0,5 ml y se adiciono a 12 tubos de ensayos; finalmente a cada uno se le agrego los siguientes reactivos; cloruro férrico (compuestos fenólicos), gelatina- sal (taninos catéquicos), shinoda (flavonoides), Liebermann Burchard (esteroides y triterpenoides) Baljet (lactonas alfa y beta insaturadas y cumarinas), mientras Dragendorff, Mayer y Wagner (alcaloides), Borntrager (antraquinonas) e hidróxido de sodio (antocianinas) 29,8. 2.5.3 Actividad antibacteriana método Kirby Bauer o antibiograma Este ensayo se realizó en el Laboratorio Biológico y Análisis Clínico Santa Rosa E.I.R.L. con cepas tipificadas de Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 y Escherichia coli ATCC 25922 por quintuplicado. a) Preparación de los extractos a ensayar: una vez determinada la solubilidad del extracto seco se procedió a preparar las concentraciones de 90 %, 50 % y 25 %. Para lo cual se elaboró una solución madre de 5 ml (4,5 g de extracto más cantidad suficiente de etanol 70 %) 31,33. b) Activación de la cepas de Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 y Escherichia coli ATCC 25922: para la activación de las cepas ATCC se usó el producto Kwik-Stik microbiologics la cual contiene microorganismos liofilizados. Dicho dispositivo presenta un diseño de fácil manejo, en la parte superior contiene un líquido hidratante y en parte inferior la bacteria en un gránulo. Para poder sembrar en el Agar Triptona Soya (TSA) primero se prepara el dispositivo liberando el líquido hidratante y se deja 9 descender hasta el microorganismo, luego se presionó la parte inferior para obtener una buena homogenización, finalmente se embebe bien el hisopo y se realiza la transferencia a las placas de cultivo, la cual fue llevada a la incubadora a 37 °C por 24 horas 33. c) Preparación del inóculo: cumplido el tiempo de incubación se procedió a realizar los inóculos, para ello se rotularon 3 tubos de ensayos y se adiciono solución salina (NaCl 0.9 %) a cada uno. Seguidamente se tomó de 3 a 4 colonias de los cultivos con un asa de siembra y se transfirió a los tubos conteniendo la solución hasta alcanzar una turbidez semejante a la de 0,5 Mc. Farland 29,33. d) Preparación del medio de cultivo: se realizó según las indicaciones del proveedor; se pesó 11,4 g de Agar Mueller Hinton deshidratado y se adiciono 300 ml de agua destilada luego se llevó a calor y agitación constante hasta la disolución completa del agar, finalmente se procedió a esterilizar el medio en una autoclave a 15 Psi y 121 °C por 15 minutos. Finalizado el autoclavado se dejó enfriar el medio hasta 45 °C – 50 °C para ser vertido en las placas petris estériles 29. e) Inoculación de las placas: preparado el inóculo y el medio de cultivo se procedió a transferir las bacterias con la ayuda de un hisopo a las placas conteniendo el agar solidificado. La siembra fue por estrías en tres direcciones para obtener una buena uniformidad, previo a esto todas las placas fueron rotuladas donde se especificó las concentraciones y el nombre de la bacteria 28,29. f) Grupos a ensayar: se elaboraron discos de papel filtro Whatman N°1 de 6 mm de diámetro los cuales se esterilizaron. Estos previamente fueron embebidos con el extracto hidroalcohólico y finalmente fueron depositados en el medio de cultivo sembrado con las cepas bacterianas, para luego ser incubados a 37 °C por 24 horas 34. 10 Preparación de los grupos: - Discos embebidos con etanol 70 %. - Discos de ciprofloxacino 5 ug. - Discos embebidos con 10 ul de extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp al 25 %. - Discos embebidos con 10 ul de extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp al 50 %. - Discos embebidos con 10 ul de extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp al 90 %. g) Interpretación de los resultados: cumplido el tiempo de incubación se procedió a medir los halos de inhibición con la ayuda de un calibrador vernier expresados en mm, estos resultados fueron comparados con la escala de sensibilidad de Duraffourd 35. (ver tabla 1) Tabla 1. Escala de sensibilidad según Duraffourd. ESTATUS MEDIDAS EN MM Sensibilidad nula (-) < 8 mm Sensible (+) > 8 mm ≤ 14 mm Muy sensible (++) >14 ≤ 20 mm Sumamente sensible (+++) > 20 mm Fuente:https://revistadigital.uce.edu.ec/index.php/odontologia/arti cle/view/1470/1425 11 2.6 Métodos de análisis estadístico Luego de la obtención de resultados de los análisis antes mencionados, se realizaron las evaluaciones mediante estadística descriptiva utilizando el paquete informático Microsoft Excel versión 2019. Asimismo, los cuadros constituidos por los halos de inhibición medidos a las 24 horas de incubación se someterán al método de análisis de varianza (ANOVA) y el método de tukey, para determinar la diferencia significativa para lo cual se usará el programa SPSS 29,36. 2.7 Aspectos éticos Se respetarán las Buenas Prácticas de Laboratorio cumpliendo con los protocolos de bioseguridad y el respeto al medio ambiente debido a que el estudio es in vitro. Además se respetarán los principios de transparencia y veracidad 28,36,37. 12 III. RESULTADOS 3.1 De las pruebas de solubilidad Tabla 2. Solubilidades del extracto hidroalcohólico desecado de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish). TUBOS SOLVENTES RESULTADOS N° 1 Éter de petróleo - N° 2 Diclorometano - N° 3 Cloroformo - N° 4 Butanol - N° 5 Etanol 96 - N° 6 Etanol 70 +++ N° 7 Agua destilada + N° 8 Dimetilsulfóxido ++ Fuente: Elaboración propia Dónde: (-) Insoluble, (+) Poco soluble, (++) Soluble, (+++) Muy soluble En la tabla 2, se observó que el extracto hidroalcohólico de las hojas de olmish fue muy soluble en etanol 70 %, soluble en dimetilsulfóxido y poco soluble en agua destilada. 13 3.2 De la marcha fitoquímica Tabla 3. Marcha fitoquímica del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish). TUBOS ENSAYOS METABOLITOS RESULTADOS N° 1 Borntrager Antraquinonas + N° 2 Cloruro férrico Compuestos fenólicos +++ Liebermann- Terpenos y esteroides N° 3 Burchard - N° 4 Dragendorff Alcaloides +++ N° 5 Mayer Alcaloides - N° 6 Wagner Alcaloides + N° 7 Baljet Lactonas α,β-insaturadas +++ N° 8 Gelatina Taninos - N° 9 Gelatina-sal Taninos - N° 10 NaOH 10% Antocianinas + N° 11 Espuma Saponinas + N° 12 Shinoda Flavonoides + Fuente: Elaboración propia Donde:(-) ausencia, (+) leve, (++) moderado, (+++) abundante En la tabla 3. Se observó que en el extracto hidroalcohólico de las hojas de olmish se detectó de manera abundante compuestos fenólicos, alcaloides, Lactonas α, β – insaturadas y cumarinas, mientras la presencia de antraquinonas, antocianinas, saponinas y flavonoides fue leve, y hubo ausencia para taninos, triterpenos y esteroides. 14 3.3 Del efecto antibacteriano Tabla 4. Efecto antibacteriano in vitro del extracto Hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) por el método de Kirby Bauer. Concentración del extracto hidroalcohólico de las hojas Ciprofloxacino Etanol Ensayo de Solanum aphyodendron (control) (blanco) microbiológico S. Knapp (olmish) 25 % 50 % 90 % 5 ug 70 % Salmonella enteritidis ATCC 13076 6 6 6 33,73 6 6 6 6 33,78 6 Halos de 6 6 6 33,75 6 inhibición (mm) 6 6 6 33,75 6 6 6 6 33,73 6 Promedio 6 6 6 33,75 6 Shigella sonnei ATCC 25931 9,51 10,60 12,39 37,00 6 9,50 10,61 12,38 37,01 6 Halos de 9,48 10,58 12,35 37,00 6 inhibición (mm) 9,52 10,57 12,38 37,10 6 9,50 10,60 12,36 37,03 6 Promedio 9,50 10,59 12,37 37,03 6 Escherichia coli ATCC 25922 6 6 6,95 35,30 6 6 6 6,94 35,32 6 Halos de 6 6 6,95 35,30 6 inhibición (mm) 6 6 6,97 35,25 6 6 6 6,95 35,29 6 Promedio 6 6 6,95 35,29 6 Fuente: Elaboración propia. 15 En la tabla 4. Se observó que el efecto antibacteriano in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) presentó actividad frente a Shigella sonnei ATCC 25931 a las concentraciones de 25 %, 50 %, 90 % con halos de inhibición de 9,50 mm, 10,59 mm y 12,37 mm respectivamente, y además se determinó que ciprofloxacino fue más sensible en comparación con el extracto. En Salmonella enteritidis ATCC 13076 y Escherichia coli ATCC 25922 no se observó actividad. Tabla 5. Estadísticos descriptivos de los resultados del ensayo microbiológico Descriptivos Salmonella Shigella Escherichia enteritidis sonnei ATCC coli ATCC ATCC 13076 25931 25922 Estadísticos Media 11,5496 15,0988 12,0488 Mediana 6,0000 10,6000 6,0000 Moda 6,00 6,00 6,00 Desv. Desviación 11,32808 11,39034 11,86722 Varianza 128,325 129,740 140,831 Asimetría 1,597 1,457 1,594 Error estándar de asimetría ,464 ,464 ,464 Curtosis ,593 ,394 ,587 Error estándar de curtosis ,902 ,902 ,902 Rango 27,78 31,10 29,32 Fuente: Programa estadístico Excel 2019. En la tabla 5 se evidencia la estadística descriptiva con 95 % de intervalo de confianza para las medidas de tendencia central (media, mediana) y medidas de dispersión (rango, desviación estándar) correspondientemente. Luego se ejecutó un estadístico inferencial para determinar diferencia de medias de los grupos mediante el análisis de varianzas (ANOVA). 16 Tabla 6. Comparación de medias por ANOVA ANOVA Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática Salmonella Entre 3079,806 4 769,952 9166089,333 ,000 enteritidis grupos ATCC 13076 Dentro ,002 20 ,000 de grupos Total 3079,808 24 Shigella Entre 3113,744 4 778,436 1538411,138 ,000 sonnei grupos ATCC 25931 Dentro ,010 20 ,001 de grupos Total 3113,754 24 Escherichia Entre 3379,938 4 844,985 5348003,646 ,000 coli ATCC grupos 25922 Dentro ,003 20 ,000 de grupos Total 3379,941 24 Fuente: Programa estadístico Excel 2019. La tabla 6 muestra un valor de significancia asintótica bilateral menor al 0.05 para los resultados del ensayo microbiológico in vitro con las cepas bacterianas Salmonella enteritidis, Shigella sonnei y Escherichia coli. Esto es evidencia de que existe diferencia estadísticamente significativa entre los halos de inhibición medio de todos los grupos en el ensayo microbiológico según el estadístico ANOVA. Para determinar si existen diferencias entre los halos de inhibición medio entre los grupos mediante múltiples comparaciones se utilizó el estadístico de Tukey. 17 Tabla 7. Comparaciones múltiples por la prueba de Tukey Comparaciones múltiples HSD Tukey (I) Grupo Salmonella (J) Grupo Salmonella Diferencia de Desv. Sig. Intervalo de confianza al 95% Variable dependiente enteritidis ATCC 13076 enteritidis ATCC 13076 medias (I-J) Error Límite inferior Límite superior Etanol 70° 27,74800* ,00580 ,000 27,7307 27,7653 Ciprofloxacino 5ug Ext. 25 % 27,74800 * ,00580 ,000 27,7307 27,7653 Ext. 50 % 27,74800* ,00580 ,000 27,7307 27,7653 Salmonella enteritidis Ext. 90 % 27,74800* ,00580 ,000 27,7307 27,7653 ATCC 13076 Ciprofloxacino 5ug -27,74800* ,00580 ,000 -27,7653 -27,7307 Ext. 25 % ,00000 ,00580 1,000 -,0173 ,0173 Etanol 70° Ext. 50 % ,00000 ,00580 1,000 -,0173 ,0173 Ext. 90 % ,00000 ,00580 1,000 -,0173 ,0173 Etanol 70° 31,02800* ,01423 ,000 30,9854 31,0706 Ciprofloxacino 5ug Ext. 25 % 27,52600 * ,01423 ,000 27,4834 27,5686 Ext. 50 % 26,43600* ,01423 ,000 26,3934 26,4786 Shigella sonnei ATCC Ext. 90 % 24,65600* ,01423 ,000 24,6134 24,6986 25931 Ciprofloxacino 5ug -31,02800* ,01423 ,000 -31,0706 -30,9854 Ext. 25 % -3,50200* ,01423 ,000 -3,5446 -3,4594 Etanol 70° Ext. 50 % -4,59200* ,01423 ,000 -4,6346 -4,5494 Ext. 90 % -6,37200* ,01423 ,000 -6,4146 -6,3294 Etanol 70° 29,29200* ,00795 ,000 29,2682 29,3158 Ciprofloxacino 5ug Ext. 25 % 29,29200 * ,00795 ,000 29,2682 29,3158 Ext. 50 % 29,29200* ,00795 ,000 29,2682 29,3158 Escherichia coli ATCC Ext. 90 % 28,34000* ,00795 ,000 28,3162 28,3638 25922 Ciprofloxacino 5ug -29,29200* ,00795 ,000 -29,3158 -29,2682 Etanol 70° Ext. 25 % ,00000 ,00795 1,000 -,0238 ,0238 Ext. 50 % ,00000 ,00795 1,000 -,0238 ,0238 Ext. 90 % -,95200* ,00795 ,000 -,9758 -,9282 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05. Fuente: Programa estadístico Excel 2019 18 La tabla 7 muestra que los valores de significancia asintótica bilateral son menores al 0.05 en las comparaciones entre los grupos al 25 %, 50 %, 90 % frente al grupo control (Ciprofloxacino 5 ug) en el ensayo microbiológico con la cepa bacteriana Salmonella enteritidis. Sin embargo, se evidencia una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo (Ciprofloxacino 5ug) y los grupos experimentales que favorece al grupo (Ciprofloxacino 5 ug). De igual importancia, se muestra que los valores de significancia asintótica bilateral son mayores al 0.05 en las comparaciones entre los grupos experimentales al 25 %, 50 % y 90 % frente al grupo control (Etanol 70 %) en el ensayo microbiológico con la cepa bacteriana Salmonella enteritidis. Esto es evidencia de que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de experimentación y el control. Esto es evidencia de que los grupos experimentales al 25 %, 50 % y 90 % no presentan efecto inhibidor del crecimiento de la cepa Salmonella enteritidis. Por otro lado, los valores de la significancia asintótica bilateral son menores al 0.05 en las comparaciones entre los grupos al 25 %, 50 % y 90 % frente al grupo control (Etanol 70 %) y grupo (Ciprofloxacino 5 ug) en el ensayo microbiológico con la cepa bacteriana Shigella sonnei. Esto es evidencia de que si existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales y el control. Sin embargo, se evidencia una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo (Ciprofloxacino 5 ug) y los grupos experimentales que favorece al grupo (Ciprofloxacino 5 ug). Sin embargo, se evidencia que los grupos experimentales al 25 %, 50 % y 90 % si presentan efecto inhibidor del crecimiento de la cepa Shigella sonnei. Finalmente, los valores de significancia asintótica bilateral son menores al 0.05 en las comparaciones entre los grupos al 25 %, 50 %, 90 % frente al grupo control (Ciprofloxacino 5 ug) en el ensayo microbiológico con la cepa bacteriana Escherichia coli. Esto es evidencia de que existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de experimentación y el control, pero que favorece al grupo (Ciprofloxacino 5 ug). 19 Por otro lado, se muestra que los valores de significancia asintótica bilateral son mayores al 0.05 en las comparaciones entre los grupos experimentales al 25 % y 50 % frente al grupo control (Etanol 70 %) en el ensayo microbiológico con la cepa bacteriana Escherichia coli. Esto es evidencia de que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de experimentación al 25 % y 50 % y el control (Etanol 70 %). Esto es evidencia de que los grupos experimentales al 25 % y 50 % no presentan efecto inhibidor del crecimiento de la cepa Escherichia coli. Asimismo, el valor de la significancia asintótica bilateral es menor al 0.05 en las comparaciones entre los grupos al 90 % frente al grupo control (Etanol 70 %), evidenciando una diferencia estadísticamente significativa, sin embargo, respecto a la escala de Duraffourd, no se considera como efecto inhibidor del crecimiento de la cepa Escherichia coli. Tabla 8. Escala de Duraffourd para el extracto hidroalcohólico de las hojas de olmish. Escala de sensibilidad de Duraffourd Salmonella Shigella sonnei Escherichia coli DATOS enteritidis ATCC ATCC 25931 ATCC 25022 13076 25 % - + - 50 % - + - 90 % - + - Etanol 70 % - - - Ciprofloxacino +++ +++ +++ 5ug Fuente: Elaboración propia. Dónde: (-) sensibilidad nula < 8 mm, (+) sensible > 8 mm y ≤ 14 mm, (++) muy sensible < 14 mm y ≤ 20 mm, (+++) sumamente sensible > 20 mm. 20 En la tabla 8 se aprecia que Shigella sonnei fue sensible a las 3 concentraciones del extracto hidroalcohólico de las hojas, mientras salmonella enteritidis y Escherichia coli presentaron sensibilidad nula, por otro lado las cepas bacterianos fueron sumamente sensibles a ciprofloxacino 5 ug. Tabla 9. Porcentaje del efecto inhibitorio del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp Porcentaje de efecto inhibitorio Salmonella Shigella sonnei Escherichia coli DATOS enteritidis ATCC ATCC 25931 ATCC 25022 13076 25 % 0 25.65 % 0 50 % 0 28,60 % 0 90 % 0 33,40 % 19,69 % Etanol 70 % 0 0 0 Ciprofloxacino 100 % 100 % 100 % 5ug Fuente: Elaboración propia. Dónde: % ℎ = á 100 á En la tabla 9 se aprecia que el extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp a las concentraciones de 25, 50 y 90 % frente a Shigella sonnei presentó los porcentajes de inhibición de 24,47, 28,60 y 34,40 % respectivamente, mientras para Escherichia coli la concentración al 90 % presentó un porcentaje de inhibición de 19,69 % y para salmonella enteritidis no hubo porcentaje de inhibición; mientras ciprofloxacino presento 100 % para todas las bacterias. 21 IV. DISCUSIÓN 4.1 Discusión de resultados En el presente estudio del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) frente a bacterias como Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei ATCC 25931 y Escherichia coli ATCC 25922, se realizó el ensayo de la prueba de solubilidad, en la que los resultados según la tabla 2, mostraron que el extracto hidroalcohólico de olmish, fue muy soluble en etanol de 70 %, soluble en dimetilsulfóxido y poco soluble en agua destilada. Por ello se decidió realizar los siguientes ensayos en el solvente que presentó mayor afinidad. En el ensayo de tamizaje fitoquímico realizado según la metodología de Lock. (2016)8, se detectó que el extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S Knapp presento compuestos fenólicos, alcaloides y lactonas α, β-insaturadas, que de acuerdo a la tabla 3 fueron los más abundantes; además se determinó que el extracto tiene en menor abundancia antraquinonas, antocianinas, saponinas y flavonoides. Estos resultados concuerdan con el estudio de Mendoza J. (2022)38, realizado a las hojas de Solanum hispidum Pers especie del mismo género, donde se determinaron compuestos fenólicos, alcaloides, flavonoides, esteroides, taninos y saponinas. Del mismo modo, en el trabajo de investigación de Chang L, et al (2013)39, se observó que la especie Solanum nigrum presentó alcaloides, taninos, flavonoides, saponinas y cumarinas. Asimismo los resultados fitoquímicos realizados a las especias Solanum radicans, Solanum crinitioes, Solanum dolichosepalum, solanum mammosun y Solanum barbeyanum presentaron en su mayoría metabolitos secundarios similares 21,24,26,27. Esto conllevaría de manera favorable a utilizar este recurso vegetal para tratar diferentes dolencias en beneficio de la población, ya que en la actualidad contamos con un gran número de especies del genero Solanum con propiedades medicinales. 22 En el ensayo microbiológico para determinar el efecto antibacteriano in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp, se apreció según la tabla 4 que Salmonella enteritidis ATCC 13076 no presentó inhibición a las concentraciones de 25 %, 50 % y 90 %, ya que el halo determinado fue de 6 mm. Además, se evidenció que los 3 grupos experimentales no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p>0.05) por las pruebas estadísticas de ANOVA y Tukey. Por lo tanto, según la escala de Duraffourd esta cepa bacteriana tiene sensibilidad nula para los 3 extractos en investigación. Asimismo Espinoza G, et al (2021)40, determinaron en un estudio realizado que Solanum sessiliflorum Dunal presentó actividad sobre Salmonella enteritidis y Staphylococcus aureus, siendo el halo de inhibición para el primero de 9,49 mm a la concentración de 75 % y el segundo a las concentraciones de 25 %, 50 % y 75 % presentó halos de inhibición de 7,42 mm, 9,35 mm y 11,16 mm respectivamente. Además Huayhua H, et al. (2021)41, en un trabajo de investigación sobre el efecto antibacteriano de Solanum juzepczukki (tunta) determinaron que Salmonella entérica subsp. entérica serovar presentó un halo de inhibición media de 10,40 mm a 30 ul de extracto de tunta. Por otro lado, en el ensayo microbiológico in vitro para determinar el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) a las concentraciones de 25 %, 50 % y 90 % frente a cepas de Shigella sonnei ATCC 25931, evidenció que el extracto al 25 % generó un halo de inhibición medio de 9,50 mm, seguido de los extractos al 50 % y 90 % con halos de inhibición medios de 10,59 y 12,37 mm respectivamente. Además, se evidenció que los 3 grupos experimentales presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) por las pruebas estadísticas de ANOVA y Tukey. Por lo tanto, según la escala de Duraffourd esta cepa bacteriana tiene una sensibilidad límite para los 3 extractos. 23 De igual manera Guzman W. (2014)42, en un estudio de investigación determino la actividad antibacteriana a la especie Solanum nigrum L. observando que a la concentración de 300 mg/ml los halos de inhibición fueron 11,3, 11,6, 16,2 y 13,6 mm; para Salmonella entérica subsp, entérica, Escherichia coli, Shigella sonnei y Proteus hauseri, respectivamente Finalmente, en el ensayo microbiológico in vitro para determinar el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) a las concentraciones de 25 %, 50 % y 90 % frente a cepas de Escherichia coli ATCC 25922, se evidenciaron que los extractos al 25 % y 50 % generaron un halo de inhibición medio de 6,00 mm para cada uno respectivamente, asimismo un halo de inhibición de 6.95 mm para el extracto al 90 %. Además, se evidenció que los 3 grupos experimentales no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p>0.05) por las pruebas estadísticas de ANOVA y Tukey. Por lo tanto, según la escala de Duraffourd esta cepa bacteriana tiene sensibilidad nula para los 3 extractos en investigación. Según Paz S. (2018)43, al realizar un estudio a la especie Solanum Tuberosum (papa fermentada), determinó que el extracto acuoso a las concentraciones de 25, 50 y 100 % no presentó efecto antibacteriano al someterlos en ensayo microbiológico con Escherichia coli y Staphylococcus aureus, ya que se observó un halo de inhibición de 0 mm. Con esto se podría decir que las cepas de Escherichia coli son resistentes a algunos extractos. Por su parte Cañon T, et al (2018)26, reportaron en su investigación microbiológica que las cepas de Escherichia coli no presentaron sensibilidad a los extractos de tallos, hojas y frutos de Solanum crinitipes, mientras que para Staphylococcus aureus fue una actividad baja para el extracto de hojas. 24 Según los estudios realizados se pudo evidenciar que la especie Solanum como tal presenta efecto antibacteriano sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas en mayor o menor proporción, dicha acción se debe a los metabolitos secundarios que esta presenta. Esta actividad bacteriana dependerá del solvente y de que parte de la planta se utiliza 826,29,42,. Una de las limitaciones del presente estudio corresponde a la escasa información científica con aplicaciones microbiológicas de la especie Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish), que imposibilita hacer comparaciones específicas y exactas. Por ello se procedió a analizar sobre las mismas especies. 25 4.2 Conclusiones Los estudios realizados en el presente trabajo nos permiten llegar a las siguientes conclusiones: - El extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) presentó efecto antibacteriana in vitro frente a cepas de Shigella sonnei pero no presentó efecto antibacteriana frente a cepas de Salmonella enteritidis ni de Escherichia coli. - Los metabolitos secundarios que se detectaron en la prueba de tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) fueron los compuestos fenólicos, alcaloides y lactonas α, β insaturadas, siendo estos los responsables de causar el efecto antibacteriano. - La concentración del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) que posee efecto antibacteriano in vitro frente a las cepas de Shigella sonnei son al 25 %, 50 % y 90 %, mientras que no hubo concentración que generó halo de inhibición frente a Salmonella enteritidis y a Escherichia coli. - El extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) al 25 %, 50 % y 90 % no superan el efecto inhibidor del Ciprofloxacino 5 ug frente a las tres bacterias gramnegativas (Salmonella Enteritidis, Shigella sonnei y Escherichia coli). 26 4.3 Recomendaciones - Se recomienda realizar una investigación a las hojas de solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) sobre bacterias Grampositivas. - Asimismo realizar un trabajo de investigación a las hojas de solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) sobre la actividad citotóxica y antioxidante. - Por otro lado realizar un análisis fitoquímico para determinar cuantitativamente y estructuralmente qué metabolitos secundarios están presentes en las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp. 27 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Zuñiga I, Caro J. Enfermedades transmitidas por los alimentos: una mirada puntual para el personal de salud. Enf Infec Microbiol [Internet]. 2017 [Acceso: 27/10/2021] 37(3):95-104. disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/micro/ei-2017/ei173e.pdf 2. Povea E, Hevia D. La enfermedad diarreica aguda. Rev Cubana Pedriatr [Internet]. 2019 [Acceso: 27/10/2021] 91(4):1-5. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/ped/v91n4/1561-3119-ped-91-04-e928.pdf 3. Organización Mundial de la Salud. Inocuidad de alimentos [Internet]. 2020 [Acceso: 28/10/2021]. Disponible en: https://www.who.int/es/news- room/fact-sheets/detail/food-safety 4. Organización Mundial de la Salud. Enfermedades diarreicas [Internet]. 2017 [Acceso:28/10/2021]. Disponible en: https://www.who.int/es/news- room/fact-sheets/detail/diarrhoeal-disease 5. Centro Nacional de Epidemiología Prevención y Control de Enfermedades, Ministerio de Salud. 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Trujillo: Universidad Cesar Vallejo; 2018. 34 ANEXOS 35 ANEXO A: Operacionalización de las variables VARIABLES TIPO DE DEFINICIÓN DEFINICIÓNVARIABLE CONCEPTUAL OPERACIONAL DIMENSIONES INDICADORES N° DE ITEMS VALOR FINAL CRITERIOS Extracto (+++) Abundante Sustancia hidroalcohólico Tamizaje Identificación de (++) Moderado Rango de VARIABLE metabolitos 4 (+) Leve presencia y INDEPENDIENT obtenida de la es la forma fitoquímico ausencia E: Extracto mezcla de las práctica de secundarios. (-) Ausencia hidroalcohólico hojas de concentrar y de las hojas de Cualitativo Solanum obtener los Solanum aphyodendron principios aphyodendron S. con una activos que Knapp (olmish). solución de sintetizan losetanol y agua. recursos Diluciones del 25 % Concentración vegetales. extracto Concentraciones hidroalcohólico especificas 3 50 % final después 90 % de a dilución VARIABLE Conjunto de El efecto DEPENDIENTE: compuestos que antibacteriano Efecto eliminan o se determinará antibacteriano in Cuantitativo reducen el mediante el Inhibición de Halos de Crecimiento o sin Evidencia de Método Kirby crecimiento inhibición (mm) 2 crecimiento inhibición devitro sobre crecimiento bacterias bacteriano. Bauer o método bacteriano crecimiento gramnegativas. de difusión. Fuente: Elaboración propio 1 36 ANEXO B: Instrumentos de recolección de datos Solubilidad del extracto hidroalcohólico desecado TUBOS SOLVENTES RESULTADOS N° 1 Éter de petróleo N° 2 Diclorometano N° 3 Cloroformo N° 4 Butanol N° 5 Etanol 96 N° 6 Etanol 70 N° 7 Agua destilada N° 8 Dimetilsulfóxido Fuente: Elaboración propia Dónde: (-) insoluble, (+) poco soluble, (++) soluble, (+++) muy soluble 37 Marcha fitoquímica del extracto hidroalcohólico de las hojas de olmish TUBOS ENSAYOS METABOLITOS RESULTADOS N° 1 Borntrager Antraquinonas N° 2 Cloruro férrico Compuestos fenólicos Liebermann- Terpenos y esteroides N° 3 Burchard N° 4 Dragendorff Alcaloides N° 5 Mayer Alcaloides N° 6 Wagner Alcaloides N° 7 Baljet Lactonas α,β-insaturadas N° 8 Gelatina Taninos N° 9 Gelatina-sal Taninos N° 10 NaOH 10% Antocianinas N° 11 Espuma Saponinas N° 12 Shinoda Flavonoides Fuente: Elaboración propia Donde:(-) ausencia, (+) leve, (++) moderado, (+++) abundante 38 Resultados del análisis in vitro por el método de Kirby-Bauer Concentración del extracto hidroalcohólico de las hojas Ciprofloxacino Etanol Ensayo de Solanum aphyodendron (control) (blanco) microbiológico S. Knapp (olmish) 25 % 50 % 90 % 5 ug 70 % Salmonella enteritidis ATCC 13076 Halos de inhibición (mm) Promedio Shigella sonnei ATCC 25931 Halos de inhibición (mm) Promedio Escherichia coli ATCC 25922 Halos de inhibición (mm) Promedio Fuente: Elaboración propia. Dónde: (-) sensibilidad nula, (+) sensible, (++) muy sensible, (+++) sumamente sensible. 39 ANEXO C. Certificado de clasificación taxonómica 40 ANEXO D. Certificado de análisis de Salmonella enteritidis ATCC 13076. 41 ANEXO E. Certificado de análisis de Shigella sonnei ATCC 25931. 42 ANEXO F. Certificado de análisis de Escherichia coli ATCC 25922 43 ANEXO G. Certificado del ensayo microbiológico del extracto hidroalcohólico de las hoja de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) sobre cepas de Salmonella Enteritidis, Shigella sonnei y Escherichia coli. 44 ANEXO H. Resolución de proyecto de investigación 45 ANEXO I. Evidencias del trabajo de campo Hojas en buen estado Hojas en mal estado Hojas seleccionadas Figura 3. Selección y limpieza de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) Fuente: Elaboración propia Lavado Enjuague con agua destilada Escurrido Figura 2. Lavado de las hojas de olmish que están en buen estado Fuente: Elaboración propia 46 Secado a temperatura ambiente Secado en una estufa a 40 °C Figura 4. Secado de las hojas limpias Fuente: Elaboración propia Hojas secas Molienda Hojas trituradas Figura 5. Molienda de las hojas secas de olmish Fuente: Elaboración propia 47 Agregado del extracto molido al frasco Adicionado de etanol 70 % Homogenizado Figura 6. Preparación del macerado Fuente: Elaboración propia Figura 7. Filtrado del macerado Fuente: Elaboración propia 48 Trasvasó del filtrado a Llevado de las placas a la unas placas de vidrio estufa Extracto seco Figura 8. Obtención del extracto seco de las hojas de Solanum aphyodendron S. Knapp (olmish) Fuente: Elaboración propia Figura 9. Ensayo de solubilidad del extracto seco de olmish Fuente: Elaboración propia 49 Figura 10. Ensayo fitoquímico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Solanum aphyodendron S Knapp (olmish) Fuente: Elaboración propia Figura 11. Preparación del medio de cultivo, Agar Mueller Hinton Fuente: Elaboración propia 50 Figura 12. Preparación del inoculo y el estándar 0,5 McFarland Fuente: Elaboración propia Figura 13. Siembra en placas de Salmonella enteritidis, Shigella sonnei y Escherichia coli Fuente: Elaboración propia 51 Figura 14. Preparación de discos del extracto hidroalcohólico de las hojas de olmish a las concentraciones de 25 %, 50 % y 90 % Fuente: Elaboración propia Figura 15. Colocación de los discos sobre las placas sembradas con las bacterias Gram negativas Fuente: Elaboración propia 52 Figura 16. Incubación de las placas conteniendo el extracto hidroalcohólico de olmish y las cepas bacterianas Fuente: Elaboración propia Salmonella enteritidis Shigella sonnei Escherichia coli Figura 17. Lectura de los resultados y medición de loa halos de inhibición con un calibrador Vernier Fuente: Elaboración propia 53